2012最受歡迎的測序文章，點滴決定成敗

　　作為測序生力軍的第三代測序技術能夠大大增加測序的效率和通量，不過很顯然第二代測序技術仍會繼續被廣泛采用。近日BioTechniques雜志評出了今年最受歡迎的兩篇測序文章以饗讀者，而這兩篇文章正是目前技術過渡時期的寫照。

　　近年來，基因組學、轉錄組學和宏基因組學等領域迎來了爆炸式的增長，這都要歸功于高通量測序技術的日新月異。盡管第二代測序方法最終會被新技術取代，但在不遠的將來這一成熟技術仍將被研究人員們廣泛采用。

　　下面為您介紹的是今年BioTechniques雜志上最受歡迎的兩篇測序文章，一篇顯著降低了二代測序技術文庫制備階段的PCR擴增偏好，一篇優化了第三代測序方案使其能更有效地幫助人們完成基因組草圖。這兩篇文章受到的極大關注也說明，雖然引入新方法或對實驗方案進行獨創性修正極易受到廣泛關注，但對公認的成熟技術進行優化修補也同樣重要，二者都能給科學家們帶來很大幫助。

　　構建測序文庫是第二代測序的經典步驟，經PCR擴增得到足夠產物用于測序是非常關鍵的一步。不過擴增時的PCR偏好往往會導致嚴重的問題，PCR偏好會使擴增后的文庫無法再現原始樣品中的復雜性，從而影響以測序為基礎的各種組學分析。Dabney和Meyer二月份發表的這篇文章描述了他們在制備 Illumina人類基因組DNA測序文庫的過程中，對十種不同PCR聚合酶/緩沖體系進行了系統性和綜合性評估，分析了這些體系對兩種PCR偏好性的影響(GC含量和片斷大小)。此外，他們還詳細評估了一系列PCR 聚合酶/緩沖液體系在建立古代人類DNA測序文庫中的表現。古代DNA樣本是一種極端情況，因為樣本質量差會嚴重放大PCR偏好性的影響。但令人驚訝的是，在GC含量和片斷長度偏好性上表現最糟糕的就是以往最廣為推薦適宜Illumina文庫構建的PCR聚合酶，對現代和古代DNA樣本來說都是如此。不過，文章也推薦了最佳PCR 聚合酶/緩沖液體系，這對于正在進行第二代測序的研究者們來說非常寶貴。這項研究向人們展示，即使是相當成熟的二代測序技術也還有相當大的優化空間，這一點令人振奮。

　　第二代測序技術的發展已經使基因組測序的時間和成本大大降低，近年來已測序的生物數量呈指數增長。現在的當務之急是填補基因組草圖中的缺口，對一些不確定的區域進行重測序，以得到高質量的完成基因組。這樣的工程需要對覆蓋基因組缺口和重測序區域的PCR擴增子進行定向測序，但如果分別對這些擴增子單獨進行 Sanger測序成本就太高了。顯然將各種長度的PCR擴增子混合在一起形成文庫，再利用第三代測序技術進行測序更為劃算，例如用測序讀長更長的 Pacific Biosciences(PacBio)單分子測序方法。不過這一技術本身也存在一定的偏好性，較短的PCR擴增子會優先進入PacBio反應孔，從而使較大擴增子的覆蓋度可能不夠。Han及其同事在七月份發表的這篇文章中，對PacBio方案進行了簡單的改動，有效克服了上述障礙。他們在PCR擴增子加入到擴增子池中時，依據各擴增子的大小調節其molar mass ratio，由此大大增加了對較大擴增子的測序覆蓋度。他們用這一方法來補全16種不同細菌的基因組，幾乎填補了所有大于2.5kb的基因組缺口，這樣的缺口是無法用一輪Sanger測序就補全的。顯然，這一技術更有效也更經濟，將大大推動基因組補全項目，也會使PacBio平臺得到更廣泛的應用。