關閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預電泳時擴散出來的尿素，然后立即用毛細管進樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、T、C。加樣完畢后，立即電泳。開始可用30 V/cm進行電泳，5分鐘后可提高至40～60 V/cm，并保持恒壓狀態。一般來說，一個55 cm長，0.2 mm厚的凝膠板，在2500 V恒壓狀態下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩定地從28 mA降至25 mA。為了能讀到更長的序列，可采用兩輪或多輪上樣。
【注意】
① 上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達到55℃左右，如果還沒有達到，則應等溫度達到后才能上樣電泳。
② 一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因為太高的電壓會使凝膠的分辨率降低，并且使帶擴散。電泳中可進行恒功率電泳。