脯氨酸側鏈的獨特環狀結構使脯氨酸與其他氨基酸相比具有出色的構象剛性。它還影響脯氨酸和其他氨基酸之間的肽鍵形成速率。當脯氨酸與肽鍵中的酰胺結合時，它的氮不與任何氫結合，這意味著它不能作為氫鍵供體，但可以作為氫鍵受體。
與傳入的Pro-tRNAPro形成肽鍵的速度比任何其他tRNA慢得多，這是N-烷基氨基酸的一般特征。進入的tRNA和以脯氨酸結尾的鏈之間的肽鍵形成也很慢；脯氨酸-脯氨酸鍵的形成速度最慢。
脯氨酸的特殊構象剛性影響脯氨酸殘基附近蛋白質的二級結構，并可能解釋脯氨酸在嗜熱生物蛋白質中的較高流行率。蛋白質二級結構可以用蛋白質骨架的二面角φ、ψ和ω來描述。脯氨酸側鏈的環狀結構將角度φ鎖定在大約-65°。
脯氨酸在常規二級結構元素（如α螺旋和β折疊）中間充當結構破壞劑；然而，脯氨酸通常作為α螺旋的xxx個殘基存在，也存在于β折疊的邊緣鏈中。脯氨酸也常見于轉角（另一種二級結構）中，有助于形成β轉角。這可能解釋了脯氨酸通常暴露在溶劑中的奇怪事實，盡管它具有完全脂肪族側鏈。
連續的多個脯氨酸和/或羥脯氨酸可以產生多脯氨酸螺旋，這是膠原蛋白中的主要二級結構。通過脯氨酰羥化酶（或其他吸電子取代基如氟的添加）對脯氨酸的羥基化顯著增加了膠原蛋白的構象穩定性。因此，脯氨酸的羥基化是維持高等生物結締組織的關鍵生化過程。壞血病等嚴重疾病可能由這種羥基化的缺陷引起，例如脯氨酰羥化酶突變或缺乏必需的抗壞血酸（維生素C）輔因子。