1、合成cDNA的引物：合成cDNA引物時，通常采用隨機六核苷酸引物能夠有效地指導從RNA有效地合成第一鏈cDNA：
2、避免RNA酶的污染：在合成cDNA第一鏈時，應使用RNA酶抑制劑，進行RT-PCR時，用于合成cDNA第一鏈的RNA不會對PCR有影響，因此沒有必要用堿或RNA酶處理；
3、不同來源的逆轉錄酶均可較好地用于第一鏈cDNA的合成，但不同來源的逆轉錄酶反應溫度有所不同。如來自鳥類成髓細胞瘤病毒（AMV）與來自鼠白血病毒莫勒尼株（Mo-MLV）均可用于合成第一鏈cDNA，AMV要求的反轉錄溫度為42℃，而Mo-MLV則要求37℃，相對而言，Mo-MLV比較適合于RT-PCR，但由于其作用的最適溫度為37℃，較AMV的42℃低，因此，對于具有較高二級結構的RNA模板可能會帶來不利的影響。