某些為催化活性所必需的，與酶蛋白疏松結合的小分子量的有機物質。一部分酶除蛋白質部分外，尚含有對它們的功能直接有關的一些無機或有機成分，這些成分統稱為酶的輔因子，如果缺少這些成分，酶就顯不出活性。
輔因子包括金屬離子和一些分子量不大的有機化合物。一般常見的金屬離子有鋅離子(Zn()、鎂離子(Mg()、鐵離子(Fe()、銅離子(Cu()等，例如醇脫氫酶含鋅、精氨酸酶含錳、而多酚氧化酶則含銅等。
與酶蛋白結合很松弛，用透析和其它方法很易將它們與酶分開的稱為輔酶（Coenzyme）——還有激活劑與輔基之分。輔酶盡管不同于酶的底物，但在作用方式上和底物類似，在酶反應過程中與酶結合、分離及反復循環。輔酶用量確定可將它們按底物處理。例如乳酸脫氫酶中輔酶按底物動力學方程計算。
有不少酶既含有金屬輔因子也含有輔酶。許多輔酶是或維生素的衍生物。作為輔酶的B族維生素及其衍生物
20世紀前50年在維生素研究中的突出成就就是分離和鑒定了許多維生素（特別是B族維生素）并闡明了它們在人體內的作用。發現不少維生素類(特別是B族維生素或其衍生物)是有機體中一些重要酶類的輔酶，它們的需要量雖不多但必須從食物中攝取。
在幾種重要的代謝反應中起作用。在二羧酸的異構作用中，例如在谷氨酸轉化為甲基天冬氨酸的酶促反應中，在乙二醇和甘油轉化為醛類，生物合成甲基基團以及核苷的合成中需要輔酶B12。根據酶催化反應最適條件的要求，原則上在酶測定體系中應加入一定量的輔助因子。脫輔基酶蛋白與輔基孵育一段時間后，酶活性才會恢復，因此，往往需要樣品與試劑中的輔基先預孵育的過程。輔基的用量往往較少。
輔酶盡管不同于酶的底物，但在作用方式上和底物類似，在酶反應過程中與酶結合、分離及反復循環。輔酶用量的確定可將它們按底物處理。例如乳酸脫氫酶中輔酶按雙底物動力學方程計算。
激活劑（activator）的化學本質是金屬離子，可以是酶的活性中心，也可以通過其他機制激活酶的活性。作為激活劑的金屬離子，其影響酶促反應的動力學更加復雜。最常見的是二價金屬離子如Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等。重金屬離子大多是酶的變性劑。金屬離子之間往往存在相互拮抗或相互抑制。在酶測定體系中經常加入EDTA目的是螯合一部分非必要的離子。合適的金屬離子濃度是必要的，過量的離子往往抑制酶反應速度。由于激活劑的動力學往往與酶的動力學不同，這就可以解釋不同的樣品與反應液的比例，造成酶活性測定結果的不呈比例。N-乙酰半胱氨酸對肌酸激酶的激活作用與此類似。激活劑的用量一般通過反復實驗來確定。