通常情況下其底物是由肽鍵連接的兩個氨基酸殘基所組成的二肽化合物,并要求兩兩相鄰氨基酸殘基上的α-氨基和α-羧基同時存在。
二肽酶在體內通常由腸黏膜細胞中產生并可分泌于胞外,把二肽水解為游離的氨基酸后,由腸壁吸收進入血液到達肝臟。