體外受精會產生多個胚胎。這會產生一些過剩的胚胎不用于臨床或不適合植入患者體內，因此可以在征得供體同意的情況下可能獲得捐贈。人類胚胎干細胞可以從這些捐贈的胚胎中獲得，或者還可以使用患者的細胞和捐贈的卵子從克隆的胚胎中提取。 胚胎囊胚期的內細胞團(感興趣的細胞)與滋養層細胞分離，滋養層細胞將來分化為胚外組織。從免疫外科來說，通過抗體結合到滋養層細胞并且被另一種溶液去除，與此同時進行機械解剖以實現（內細胞團的）分離。獲得的內部細胞團細胞被接種到提供支持的細胞上。內部細胞團細胞附著在一起并進一步擴張形成未分化的人胚胎細胞系。每天需給這些細胞提供養分，而且每四至七天需通過酶解或機械分離一次。為了發生分化，將人胚胎干細胞系從支持細胞中取出以形成胚狀體，然后與含有必要信號分子的血清共培養，或者移植到三維支架中以產生。
胚胎干細胞來源于早期胚胎的內細胞團，這些細胞團是從供體雌性動物身上獲得的。馬丁·埃文斯和馬修·考夫曼報道了一種延遲胚胎植入的技術，該技術允許內細胞團數量增加。這個過程包括摘除捐獻者母親的卵巢，給她注射黃體酮以改變激素環境，從而使胚胎在子宮中保持自由。在子宮內培養4-6天后，胚胎即被收獲并在體外培養至內細胞團形成“卵圓筒狀結構”，此時內細胞團分離成單細胞，并鋪在用絲裂霉素c處理的成纖維細胞上(以防止成纖維細胞進行有絲分裂)。克隆的細胞系是由單個細胞生長而成的。埃文斯和考夫曼表明，從這些培養物中生長出來的細胞可以形成畸胎瘤和胚狀體，以及可以在體外分化，以上結果表明這些細胞具有多能性。
蓋爾·馬丁以不同的方式獲得和培養她的胚胎干細胞。她從交配后大約76小時的捐獻者母親身上取出胚胎，并在含血清的培養基中培養過夜。第二天，她通過顯微外科手術從晚期胚泡剝離出內細胞團。提取的內細胞團在含有血清的培養基并用絲裂霉素c處理的成纖維細胞上培養，并根據胚胎干細胞的狀態作調節。大約一周后，細胞系形成。這些細胞在培養物中生長并表現出多能特性，如形成畸胎瘤、進行體外分化和形成胚狀體的能力。馬丁稱這些細胞為胚胎干細胞。
目前已知飼養細胞提供的白血病抑制因子（LIF）和血清中提供的骨形態發生蛋白（BMPs）對于阻止胚胎干細胞的分化是必需的。這些因子對胚胎干細胞的衍生效率極其重要。此外，研究表明不同的小鼠品系具有不同的分離胚胎干細胞的效率。[58] 小鼠胚胎干細胞目前的用途包括制備轉基因小鼠，包括“基因敲除小鼠”。對于人類治療，需要具有患者特異性多能細胞。人類胚胎干細胞的生成產生更加困難，并面臨倫理問題。因此，除了人類胚胎干細胞研究之外，許多團隊更關注于誘導多能干細胞(iPS cells)的產生。