iPS細胞性質與胚胎干細胞相似，但在一些方面又存在差異。培養iPS細胞的環境與胚胎干細胞相似。傳統的培養方法是將iPS細胞培養在經絲裂霉素或射線滅活的小鼠胚層成纖維細胞（MEF）組成的飼養層（feeder）上，并使用含有血清及白血病抑制因子（LIF）的培養基中。目前亦已有方法可以將iPS細胞培養在化學成分明確的無血清培養基上，且不需要使用飼養層細胞的培養方法。
iPS細胞在體外具有無限增殖的潛能，也能形成與胚胎干細胞相似的緊致、平坦的細胞集落。iPS細胞在體外培養時，形態也與胚胎干細胞接近：細胞呈圓形，細胞核體積大、細胞質體積相對較小。同時，iPS細胞也表達一些胚胎干細胞中的干細胞標志物，比如Nanog蛋白、SSEA類蛋白、TRA類蛋白。iPS細胞具有分化為三個胚層細胞或組織的潛力。iPS細胞在注射入免疫缺陷性個體后，可以生成畸胎瘤，體外懸浮培養的iPS會分化形成類胚體（embryoid body，EB）。但iPS形成嵌合體（chimera）的能力較差，甚至使用iPS細胞產生嵌合體小鼠的嘗試曾一度失敗。此外，iPS細胞形成的細胞集落是異質性的，一部分iPS細胞集落中的細胞與胚胎干細胞存在較大差異，可從形態和是否表達Dlk1-Dio3等標志物將這個集落區分出來。從形態正常的細胞集落中挑選的iPS細胞的基因表達模式和胚胎干細胞基本相似，但亦存在一定差異。分析表明，一些基因的表達情況在iPS細胞中和胚胎干細胞中存在持久性的差異。