（1）取一滅菌的無RNA酶的eppendorf管，加入RNA模板和適當引物，每RNA使用0.5ug引物（如使用Not I引物接頭，用0.3ug），用H2O調整體積至15ul，70℃處理5min冷卻至室溫，離心使溶液集中在管底，再依次加入：
5X第一鏈緩沖液5ul。
RNasinRNA酶抑制劑25U
M—MLV（H）反轉錄酶200U
H2O調至總體積25ul
（2）用手指輕彈管壁，吸取5ul至另一eppendorf管，加入2~5ulCi[α一32P]dCTPdCTP（>400Ci/mmol），用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。
（3）37℃（隨機引物）或42℃（其他引物）保溫1h。
（4）取出置于冰上。
（5）摻入測定的eppendorf管加入95ul 50mM EDTA終止反應，并使總體積為100ul。可取90ul進行電泳分析（先用苯酚抽提）。另10ul進行同位素摻入放射性活性測定。
（6）第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成。
以上25ul反應總體積中所用RNA量為1ug，如合成5ugRNA，則可按比例擴大反應體積。倒5ugRNA使用125uL總體積進行合成。