為了診斷及時，除了詳細的病史，發生低血糖的年齡、時間、病情等均非常重要。新生兒特別是早產兒、未成熟兒或小于胎齡兒生后1周內發生低血糖多為新生兒暫時性低血糖。糖尿病母親的新生兒、紅細胞增多癥或頭小、身體內臟大和舌大的新生兒低血糖應考慮高胰島素血癥。低血糖發作時應及時取血測血糖、胰島素、酮體、丙氨酸、乳酸、血脂和尿酸等作為鑒別診斷的資料，必要時觀察胰升糖素刺激試驗和輸入丙氨酸和甘油后觀察血葡萄糖的反應。臨床無急性低血糖發作時可延長空腹時間至24～32小時誘發低血糖發生，有內分泌腺功能障礙表現者檢查內分泌腺功能可及時得到診斷。對酶缺乏的準確診斷必須進行酶活性的測定。
