高內涵成像分析技術在干細胞研究中的應用

發布時間：2013-03-13 08:21 原文鏈接：高內涵成像分析技術在干細胞研究中的應用

　　前言

　　隨著人類對生物學領域深入探索和科技創新的不斷發展，目前越來越多的研究院所和生物制藥公司將細胞水平的功能性研究、模型建立及藥物篩選做為一個重要的研究/研發手段。而高內涵成像分析系統就為這種細胞水平的研究提供了集高分辨率、自動化、智能化及海量信息為一體的新的檢測平臺。干細胞(stem cells)是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體干細胞。正是干細胞的這種特性，為細胞生物學的研究提供了更有力的永生化的穩定細胞株。干細胞水平的研究比在普通的細胞株提供了更接近臨床相關性的生理學信息;并且比原代細胞相比更容易獲得，且具有更好的實驗重復性。

　　干細胞的研究與其他細胞水平的研究有一些相似之處，但其關鍵的不同點在于在干細胞的研究過程中干細胞的分化。干細胞水平的實驗比傳統的單線性/單參數的實驗具有更多的檢測目標，包括其分化能力、分化過程、分化類型及不同類型的量化分析統計等。高內涵成像分析系統以其自身的高分辨率、多參數及智能化分析的特性，恰如其分的滿足了干細胞研究的以上需求，而高內涵成像系統的自動化和高通量的特點又以海量的有效數據加速了該研究的過程。

　　利用高內涵成像分析系統可完成干細胞研究的自動化圖像獲取及多參數分析，目前常用的全能性干細胞分化研究主要有三類：造血細胞、神經細胞和誘導型多能干細胞(induced pluripotent stem cell, iPS)來源的心肌細胞(圖1)。

圖1：全能干細胞分化層次圖

　　應用實例

　　1. 神經祖細胞向神經球分化研究

　　冷藏保存的神經祖細胞(StemCell Technologies, mouse Cells)培養在6孔板內，在培養基中加入不同的生長因子，培養6天后通過對每孔內神經球進行無標記相差成像，并對的神經球的面積進行自動化定量分析。結果如下(圖2)：

圖2：神經球無標記檢測及分析（ImageXpress Micro 20X 相差物鏡）

　　2. 神經干細胞向神經元及膠質細胞分化研究

　　神經干細胞在加有EGF(表皮生長因子)和bFGF(成纖維細胞生長因子)的培養基中培養1-2天，然后在分化培養基中培養12-14天。加入EPO(促紅細胞生成素)后，檢測為神經球向神經元及膠質細胞的分化情況。進行自動化圖像獲取，運用細胞分類(Cell Scoring)模塊進行神經元/膠質細胞陽性率分析，運用神經生長(Neurite Outgrowth)模塊進行神經元突觸長度及數量分析。結果如下(圖3)：

圖3：神經干細胞分化檢測及分析。圖（上）表示加入（左）及不加（右）神經細胞的分化圖片；圖（下）表示不同條件下神經元細胞的陽性率（左）及神經元突出的長度（右）。（ImageXpress Micro 20X物鏡）

　　3. 造血祖細胞向骨髓細胞及血細胞分化研究

　　人源CD34+造血祖細胞培養在96孔板中，加入多種不同的造血細胞因子組合(SCF+Flk3+TPO/SCF+IL-3+GM-SCF)后，通過檢測 CD45和CD15兩種標記物在細胞內的表達量，統計分析不同造血細胞因子組合對造血祖細胞的自我更新能力及骨髓細胞分化能力的變化。結果如下(圖4)：

圖4：檢測細胞內CD45和CD15的陽性率，評價造血祖細胞在不同條件下的自我更新能力及定向分化能力

　　4. 誘導型多能干細胞(induced pluripotent stem cell, iPS)向心肌細胞分化研究

　　iPS細胞(Celprogen)在專用培養基中培養3-7天，同時檢測7種不同標志物的表達量，以判斷心肌細胞分化及成熟的狀態。下圖(圖5)中顯示Oct4(干細胞標記物)和a-Actinin(心肌細胞標志物)在細胞內的表達情況：

圖5：iPS細胞分化情況（ImageXpress Micro 20X 物鏡）

　　5. iPS細胞來源的心肌細胞跳動實驗

　　臨床前安全性評價是藥物研發過程中非常重要的環節，早期的心臟毒理學研究將會大大降低在進入臨床研究階段后因藥物毒性帶來的投入風險。iPS細胞來源的心肌細胞跳動實驗為藥物心臟毒性評價提供了一個高效的體外細胞水平的檢測方法。心臟跳動可通過傳統電生理的方法來檢測，用高內涵成像分析系統來進行檢測及分析是一個全新的挑戰。公司最近一代的高內涵成像分析系統以其最新一代的檢測器sCMOS(采樣頻率可達100pfs)和自定義模塊分析功能，完全可出色完成心肌細胞跳動實驗的快速檢測及分析要求。

　　iPS細胞來源的心肌細胞單層培養在96或384孔板中，心肌細胞會自發跳動同步收縮。加入Calcein-AM染料孵育10min后，撤掉培養基，再加入不同濃度的化合物，置于活細胞培養裝置中，檢測心肌細胞跳動頻率的變化。結果如下(圖6)：