錢其軍教授最新文章：DNA改組技術

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　　DNA改組(DNA shuffling)是一種高通量的突變、篩選技術, 自1994年提出以來, 經過了幾十年的發展，在DNA、酶和藥物蛋白等的改造上都有突出的表現。近期來自第二軍醫大學，浙江理工大學生命科學學院的研究人員就圍繞著這種技術在腺相關病毒定向進化中的發展及其應用，展開了探討，解析了腺相關病毒AAV衣殼DNA改組方面的研究。

　　領導這一研究的是第二軍醫大學東方肝膽外科醫院的錢其軍教授，錢教授現任東方肝膽外科醫院生物治療科、基因-病毒治療實驗室主任，浙江理工大學生命科學學院新元醫藥及生物技術所副所長，曾榮獲國家杰出青年基金。腺相關病毒(adeno-associated virus, AAV)在基因治療的諸多載體中備受青睞, 具有顯著的優勢。迄今為止許多種人類和非人類AAV 血清型被確定, 這些血清型之間的衣殼蛋白VP1, VP2同源性很高, 但VP3的氨基酸序列存在很大差異。

　　AAV衣殼是AAV 侵入細胞之前與宿主表面結合的作用支撐點, 適當地改變它們的結合程度或結合方式能更好地發揮AAV載體功能，因此成為一種非常理想的基因表達載體，但是AAV 篩除存在一些不足, 如對某些重要靶細胞感染效率不高、存在機體的免疫反應等限制了其臨床研究的進展。

　　在這篇文章中，研究人員介紹了DNA改組在AAV衣殼定向進化上的技術發展和應用，指出與傳統的衣殼定點修飾方法相比, DNA 改組技術有許多優勢：(1) 它是一種有效的、高通量的突變、篩選技術. 利用該技術, 可以獲得容量大且質量高的AAV 篩除文庫;(2) 利用該技術可以減少文庫中的無效突變. 該技術不僅可以通過與野生型回交減少無效突變, 而且可以通過層層篩選積累有效突變, 這對分析有效點突變有很大的幫助;(3) 該技術無需知道隨機片段之間的重組機制, 可以直接通過 PCR 技術得到目的片段從而篩選得到目的突變體, 操作簡單, 免去許多繁瑣的設計步驟;(4) 該技術并不針對蛋白質的一項特性進化, 而是可以實現多種特性的共同進化;(5) 目前該技術改造的靶序列基因長度變長, 可以實現同源大片段間的交換, 從而可能使蛋白質功能區域發生相互交換, 這為研究蛋白質功能區域提供了新思路;(6) 將用該方法篩選到的變體與原始型作對比, 可以得知基因片段上一些重要的高突變區域, 為以后利用這些高突變區組建更豐富文庫打下了基礎。

　　錢其軍教授研究組也在AAV 衣殼DNA 改組上做了大量工作, 篩選到了幾個能特異性靶向肝癌細胞和 T 細胞的突變體。并指出未來的 AAV 衣殼DNA 改組技術將會不斷地發展, 在技術方面上, 已經出現了單鏈 DNA 改組[和限制性酶切 DNA 改組技術。

　　所謂的單鏈 DNA 改組是指將原有用來進行DNaseⅠ酶切的雙鏈 DNA 變成單鏈 DNA, 其他條件相同, 但是得到的突變體嵌合率比雙鏈 DNA 高。限制性酶切 DNA 改組是指將 DNaseⅠ換成限制性內切酶再進行DNA改組, 其嵌合率可以達到100%。在后期突變體篩選過程中, 采用突變體文庫與野生型基因文庫回交, 可以有效地降低 PCR 擴增中產生的隨機突變, 減少無效突變。

　　另外, 為了使重組病毒文庫更加豐富, AAV衣殼DNA改組技術可聯合其他技術, 比如易錯 PCR、交錯延伸 PCR、人工插入肽段等, 構建得到容量更大、質量更好的 AAV 突變體文庫. 迄今為止, 已有許多實驗室使用聯合方法篩選出了許多理想的 AAV 嵌合體。

　　未來DNA改組技術將會進一步在理論上加深人們對AAV 篩除的認識, 同時在實際應用中加強運用DNA改組后得到的新型AAV篩除, 使其具有更好的應用特性。