照高效液相色譜法(通則0512)測定。供試品溶液取本品約70mg,精密稱定,置50ml量瓶中,加流動相約30ml,超聲使溶解后,用流動相稀釋至刻度,搖勻。對照品溶液取青霉素對照品與鹽酸普魯卡因對照品適量,精密稱定,加流動相溶解并定量稀釋制成每1ml中分別約含青霉素0.8mg與普魯卡因0.54mg的溶液。系統適用性溶液取青霉素V對照品適量,加流動相溶解并稀釋制成每1ml中含青霉素ⅴ2.4mg的溶液,將此溶液與對照品溶液以1:3體積比混合。色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以緩沖液(取磷酸二氫鉀14g和40%氫氧化四丁基銨溶液6.5g溶解于約700ml水中,用1mol/L氫氧化鉀溶液調節pH值至7.0,用水稀釋至1000ml,混勻)-水乙腈(52:23:25)(用1mol/L氫氧化鉀溶液或10%稀磷酸溶液調節pH值至7.5±0.05)為流動相;檢測波長為235nm;進樣體積10l系統適用性要求系統適用性溶液色譜圖中,青霉素峰與青霉素V峰間的分離度應大于2.0。測定法精密量取供試品溶液與對照品溶液,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算供試品中C13H2oN2O2和C16H18N2O4S的含量。每1ng的C16H18N2O4S相當于1780青霉素單位。