基因克隆的基本步驟有哪些

基因克隆的基本步驟流程如下：

一、目的DNA片段的獲得：

DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群DNA分子，這些DNA分子或來自于目的生物基因組DNA或來自目的細胞mRNA逆轉錄合成的雙鏈 cDNA分子。

由于基因組DNA較大，不利于克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組DNA 或cDNA中通過PCR技術可以獲得目的基因。

二、載體的選擇：

基因克隆常用的載體有：質粒載體、噬菌體載體、柯斯質粒載體、單鏈DNA噬菌體載體、噬粒載體及酵母人工染色體等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為克隆載體、表達載體、測序載體、穿梭載體等。

三、體外重組：

體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割DNA分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過T4 DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連接。

當目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比黏端相連差些。有時為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有黏末端的表達載體實現表達時，則要將平端DNA分子通過一些修飾；

如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點等，可以獲得相應的黏末端，然后進行連接，此為修飾黏末端連接。

四、導入受體細胞：

載體DNA分子上具有能被原核宿主細胞識別的復制起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中復制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。

五、重組子的篩選：

從不同的重組DNA分子獲得的轉化子中鑒定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。發展起來的成熟篩選方法如下：

（1）插入失活法：外源DNA片段插入到位于篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點后，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑒定出轉化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法（白色菌落是重組質粒）。

（2）PCR篩選和限制酶酶切法：提取轉化子中的重組DNA分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過PCR技術篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆，用限制性內切酶酶切法進一步鑒定插入片段的大小。

（3）核酸分子雜交法：制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。

（4）免疫學篩選法：獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以采用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。