熒光RTPCR技術可快速檢測H7N9禽流感病毒

　　目前，在國內通用的確診禽類中禽流感病毒H7N9亞型的檢測技術中，除采用傳統的雞胚病毒分離方法外，通常采用核酸檢測方法，如普通PCR方法和基于熒光RT-PCR的“二步法”，但還沒有建立起采用熒光RT-PCR技術“一步法”檢測禽流感病毒H7N9亞型的方法。

　　據該項目組負責人、北京局檢驗檢疫技術中心動物實驗室博士高志強介紹，項目在實驗過程中，共建立了3種檢測方法。最終的禽流感病毒H7N9亞型雙重熒光RT-PCR檢測方法是在禽流感病毒H7亞型和N9亞型單重熒光RT-PCR檢測方法的基礎上通過優化建立，從而實現了對禽流感病毒H7N9亞型的一步快速定型。這種方法不僅能檢測最近流行的H7N9毒株，還可以用于篩查其他H7亞型毒株。此方法不僅引物特異，而且探針特異，這一“雙特異”性保證了結果的準確性，同時比普通PCR檢測技術要靈敏100~1000倍。

　　熒光RT-PCR檢測禽流感病毒原理

　　熒光ＲＴ－ＰＣＲ就是在聚合酶鏈式反應（ＰＣＲ）原有的一對特異性引物基礎上增加了一條特異性熒光雙標記探針。標準主要起草單位——北京出入境檢驗檢疫局的科研人員根據Ａ型流感病毒的核酸保守區共有序列，開發設計上百對引物和幾十條探針序列，從中篩選出了敏感、特異的引物、探針，建立快速的通用型一步法檢測活禽或禽產品中所有Ａ型禽流感病毒及針對Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９亞型的熒光ＲＴ－ＰＣＲ檢測技術。

　　ＰＣＲ反應進行一個循環，在合成了Ｎ條新鏈的同時，就水解了Ｎ條探針，并釋放出了相應數量的熒光基團。儀器所接收到熒光信號的強度與ＰＣＲ反應產物的量呈對應關系。隨著ＰＣＲ反應的循環往復，ＰＣＲ產物呈指數形式增長，熒光信號也相應增長。如果以每一個ＰＣＲ循環結束時所測得的熒光值為縱坐標，以ＰＣＲ循環數為橫坐標作圖，即可得到一條連接每一個循環后熒光值的擴增曲線。當檢測標本中含有所要檢測病原體的核酸序列時，所得到的曲線呈“Ｓ”型；而當標本中不含病原體，則ＰＣＲ過程不發生，探針不被水解，不產生熒光信號，其擴增曲線為一水平線。也就是說，擴增曲線為“Ｓ”型時，就檢出了禽流感病毒；當擴增曲線為水平線時，就沒有禽流感病毒檢出。利用熒光ＲＴ－ＰＣＲ檢測方法的４項標準有３項分別是對Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９亞型禽流感病毒檢測提出的，還有一項是通用檢測方法的標準。北京出入境檢驗檢疫局動物檢驗檢疫實驗室主任張鶴曉介紹說，該方法可以檢測Ｈ１～Ｈ１５的各種禽流感病毒。

　　禽流感病毒各亞型均屬A型流感病毒，根據A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一對特異性引物和一條特異性的熒光雙標記探針。該探針與禽流感病毒特有的共同基因特異性結合，結合部位位于引物結合區域內。探針的5’端和3’端分別標記不同的熒光素，如5’端標記FAM熒光素，它發出的熒光能夠被檢測儀器接收，稱為報告熒光基團（用R表示），3’端一般標記TAMRA熒光素，它在近距離內能吸收5’端報告熒光基團發出的熒光信號，稱為淬滅熒光基團（用Q表示）。

　　當PCR反應在退火階段時，一對引物和一條探針同時與目的基因片段結合，此時探針上R基團發出的熒光信號被Q基團所吸收，儀器檢測不到R所發出的熒光信號；當PCR反應進行到延伸階段時，Taq酶在引物的引導下，以四種核苷酸為底物，根據堿基配對的原則，沿著模板鏈合成新鏈；當鏈的延伸進行到探針結合部位時，受到探針的阻礙而無法繼續，此時的Taq酶發揮它的5’→3’外切核酸酶的功能，將探針水解成單核苷酸，消除阻礙，與此同時標記在探針上的R基團游離出來，R所發出的熒光再不為Q所吸收而被檢測儀所接收；在Taq酶的作用下繼續延伸過程合成完整的新鏈，R和Q基團均游離于溶液中，儀器可繼續檢測到R所發出的熒光信號。

　　熒光ＲＴ－ＰＣＲ檢測法特點

　　敏感性高、特異性強：熒光ＲＴ－ＰＣＲ檢測方法不僅能夠用來檢測禽流感病毒Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９亞型，對其他禽流感病毒亞型也能檢出，而且用通用型探針、引物檢測常見的其他禽類病毒，未發現交叉反應，這就說明該方法敏感性高、特異性強。

　　節約檢測時間：在檢驗檢疫實踐中，如果用僅針對某一亞型禽流感病毒的探針、引物，一個亞型一個亞型的測試，勢必會浪費人力、物力和時間。因此，先用通用型探針、引物驗證是否是禽流感病毒，再用亞型的探針、引物分型，將大大節約檢測時間。

　　不易污染：熒光ＲＴ－ＰＣＲ技術通過連接電腦分析ＰＣＲ過程中產生的熒光信號，實現了實時、在線檢測ＰＣＲ擴增過程，而無需對ＰＣＲ擴增產物進行后處理，克服了傳統的ＰＣＲ技術易污染的缺點，可實現在同一個標準的操作程序條件下進行穩定、可靠的檢測。