2009年2月22日下午，質譜沙龍第十六期活動在第二炮兵總醫院遠程會診中心會議室舉行。此次到會者除了來自發酵研究院、清華大學醫學院、北京大學分析中心、二炮總醫院、軍事醫學科學院、解放軍307醫院、北京生命科學研究所、中科院植物所、AB公司等老朋友外，還有來自北京大學人民醫院、《食品安全質量檢測技術》雜志社和《實驗與分析》雜志的新朋友。
第十六期質譜沙龍活動現場
AB公司 李丹博士
這也是春節過后的第一次活動，大家都懷著飽滿的熱情前來，AB公司的李丹博士做了簡短的發言，預祝2009年質譜沙龍活動舉辦得更加出色！此次沙龍活動就在輕松活潑的氣氛中開始，由第二炮兵總醫院藥劑科的李鵬飛老師主持。提前趕到的眾位朋友們在歡快的音樂聲中，觀看大屏幕上制作組精心制作的《新春祝福》，在此，也向所有關注沙龍的朋友們獻上誠摯的滿滿的祝福（祝福ppt下載）：
新的一年開始……祝好事接2連3、心情4季如春、生活5顏6色、7彩繽紛、偶爾8點小財、煩惱拋到9宵云外、請接受我10心10意的祝福！
祝新春快樂！
祝您一年開開心心、一生快快樂樂、一世平平安安！
愿您抱著平安、擁著健康、揣著幸福、攜著快樂、摟著溫馨、帶著甜蜜、牽著財運、拽著吉祥、邁入新年！
恭賀新禧！
匯眾人之智、攀科學高峰——質譜沙龍回顧
李鵬飛老師首先激情回顧了質譜沙龍前十五期的活動。
2007年9月，質譜沙龍在金秋時節誕生，當時由二炮總醫院-質譜檢測中心、AB公司、北京師范大學質譜中心/分析中心、北京益科生等發起人討論了沙龍活動的主旨和舉行方式：“綱領”為從事液質聯用工作的一線實驗人員，互相交流儀器使用和應用方法搭建平臺，內容以液相色譜-質譜技術為主，包括醫學、藥學、食品、保健品、農林牧漁以及基礎研究等多種領域。每月召開一次。目前會員約50余人，主要以北京地區為主，包括醫院、高校、科研單位、國家機關、相關公司和媒體朋友。形式以報告為主，邀請相關領域的專家學者做報告，研討為輔，形成自由熱烈的交流氛圍。會議地點曾經選取在二炮總醫院、北京師范大學質譜中心/分析中心、西苑醫院、發酵研究院等用戶單位。
質譜技術在近年來受到行業用戶的廣泛關注，質譜的設備保有量逐年增長，質譜的技術發展速度日新月異，應用幾乎滲透到有機分析的各個領域。對這種快速增長的新技術，質譜用戶之間渴望交流、共同進步的愿望與日俱增。因此，質譜沙龍的創辦和堅持，受到了質譜用戶們的深深喜愛。一年多來，質譜沙龍引起很多質譜愛好者的關注，每期都有新朋友參加；而從第四期開始，每期活動由“分析測試百科網（www.antpedia.com）”發布報道，使遍布全國和華語圈的更多用戶“遠程參與”和了解了這個活躍的交流平臺。
隨后，李老師回顧了沙龍上的報告：前十五期沙龍，從藥物研發、臨床藥代、食品安全、新儀器和試劑新技術新方法等方面做了50多篇專題報道。除了報告和討論，2008年5月，質譜沙龍還組織了戶外活動——“鐵血真人CS”，讓大家的身心得到更大的放松，也給沙龍增加了更多的歡聲笑語。
最后李鵬飛老師預祝2009年質譜沙龍活動有更多的朋友參與進來，集思廣益，建立一個更自由、更活躍、更高層次的交流平臺。
報告下載：質譜沙龍回顧
8021手性對映體色譜拆分及臨床前藥代動力學特性比較研究
來自軍事醫學科學院藥代動力學重點實驗室的李敬來老師，為大家介紹了題為：《8021手性對映體色譜拆分及臨床前藥代動力學特性比較研究》的報告。
軍事醫學科學院藥代動力學重點實驗室 李敬來老師
手性是自然界的普遍特征。構成自然界物質的一些手性分子雖然從原子組成來看是一摸一樣，但其空間結構完全不同，它們構成了實物和鏡像的關系，也可比喻成左右手的關系，所以叫做手性分子。市場上的絕大多數藥物都具有手性中心，研究表明，手性藥物的對映體在人體內的藥理、代謝過程、毒性和療效方面可能存在著顯著性差異。例如丙氧芬的兩種對映體就具有不同的藥理作用，一種對映體有治療作用，另一種則有副作用或毒性；異丙腎上腺素的兩個對映體互為拮抗劑；丙胺卡因它的R型對映體經過生物轉化以后可以引起高鐵血紅蛋白血癥；普萘洛爾、布洛芬、普羅帕酮等藥物都具有代謝動力學的立體選擇性…… 從上我們可以看出，開發手性藥物的光學異構體，有可能進一步提高療效，降低毒副作用。因此，單一對映體的開發研究已成為藥物研發的熱點。
M膽堿能受體是非常重要的藥物治療靶標，存在多個亞性，選擇性低、毒副作用大是這類藥物研發的主要障礙。藥物分子的特異性不僅取決于其獨特的化學結構和性質，更取決于其立體的化學結構和性質，所以提高M受體拮抗劑受體的選擇性是開發抗膽堿藥物的關鍵所在。8021是該所開發的作用于M受體的手性化合物，它的消旋體作為國家一類新藥已被批準上市，經實驗驗證左旋體表現出比消旋體有更好的抗暈效果，而右旋體無作用，因此該所決定作為一類新藥開發它的左旋體。
隨后，李老師先介紹了自己所在實驗室開展的8021手性對映體藥代動力學特性的比較研究。根據SFDA化學藥物非臨床藥代動力學研究的指導原則，如果外消旋體已經上市，開發單一對映體需要滿足兩點原則：第一點：考察擬開發的對映體是否易被轉化為另一對映體；第二點：該對映體單獨用藥與其作為外消旋體用藥時的藥代特性是否一致。
而針對該原則，專家組提出了更嚴格的研究方向：一是確定左旋體和右旋體之間是否相互轉化及轉化程度如何；二是比較左旋體、右旋體和消旋體三種物質的藥代特性的差異。
根據專家組的建議，該實驗室建立了在血漿中測定8021手性對映體色譜拆分的實驗。
一、先后對以下四種條件進行色譜分析：
色譜分析顯示，在空白血漿的位置沒有干擾，方法的特異性比較好。
二、在前面分析的基礎上，為證實左旋體和右旋體之間是否相互轉化，建立了8021消旋體的質譜色譜拆分方法：比格犬灌胃給8021左旋體，在不同的時間采血然后測定，觀察色譜圖中右旋體的位置是否出峰，即可判定左旋體是否轉化為右旋體。實驗結果表明：左旋8021在比格犬體內不會轉化為右旋8021。反之，也做了判定右旋體是否轉化為左旋體的實驗。整個實驗結果表示：兩者在比格犬體內不會相互轉化。
三、接下來通過實驗，比較了左旋體、右旋體和消旋體在比格犬體內的藥代特性。將六條比格犬隨機分成三組，分三個周期依次給它們分別灌胃給藥，然后測定藥代參數。
測定方法分為兩種：
（1）一種是非拆分的辦法，把外消旋體中的左旋8021和右旋8021作為一種物質進行測定，比較左旋體、右旋體和消旋體的藥代特性是否一致，測定數據表明左旋體、右旋體和消旋體在比格犬體內的動力學過程基本上是一致的。
（2）另一種是對給消旋體藥物的動物，進行手性拆分實驗，看看給藥后的相互作用。實驗結果表明，消旋體給藥后，右旋體的峰濃度、AUC都大于左旋體的（即不是1:1的關系）。這說明：由于右旋體的存在導致了左旋體濃度的降低。這非常支持藥效學的結果：左旋體藥效大于消旋體，右旋體無作用。（即開發左旋體藥物是非常有意義的）。舉個例子來說，吃1mg左旋體的藥物，比吃2mg消旋體的藥物，藥效要高。原因可能是：右旋體的存在減少了左旋體的吸收，或者增加了左旋體的代謝。
李老師又對8021手性對映體色譜拆分的方法進行了介紹。色譜拆分手性異構體與色譜柱、有機溶劑及其比例、緩沖溶液及其比例、緩沖溶液的濃度、PH值和溫度有關。在制定了嚴格的方法測試流程后，經實驗證實，選用蛋白色譜柱，濃度為16%的乙醇有機溶劑，5mmol乙酸銨緩沖溶液，能達到最佳分離效果。
最后簡單地介紹了該實驗室，軍事醫學科學院藥代動力學重點實驗室組建于60年代，十五期間被國家科技部指定為臨床前藥代與毒代關鍵技術平臺建設單位，獲國家“863” 重點項目基金資助。十五期間完成一類創新藥的藥代報批資料79個，二類47個，近20年來已完成200多項新藥藥代動力學研究，08年十一五期間獲國家“863” 重點項目基金資助滾動資助，獲國家重大新藥創制基金資助，軍科院重點項目資助等。該實驗室現有10臺液質聯用，氣質2臺，專門用于生物藥代分析的毛細管電泳定量PCR儀和配套的放射性同位素設備，HPLC放射檢測系統，同位素組織氧化爐等等，并介紹了這些儀器的應用范圍和該所的一些科研成果。該實驗室有自己的特色，國內最早開展生物技術藥物的藥代動力學研究，承擔國內大部分生物技術藥物的藥代評價任務；在國內率先采用巨型計算機和 VolSurf 軟件預測待合成、篩選化合物的細胞膜透性、P-糖蛋白外排及蛋白質結合等體內轉運過程；建立了多種體內、體外藥代實驗模型和快速評價技術，配合藥物設計開展化合物成藥性預測；有配套的放射性同位素實驗設備，用于研究放射性標記藥物的藥代動力學與藥物分布、排泄；在國內最早應用整體放射自顯影研究藥物的組織分布。
提問中，在座專家問了一些問題，李老師一一給予解答，并對關于單一對映體開發研究遇到的問題和大家一起進行了探討。藥物代謝動力學在藥物研發中的地位越來越重要，它貫穿于藥物研發的全過程，軍事醫學科學院藥代動力學重點實驗室有一個新藥研究多學科群體，為藥代動力學研究提供強有力的技術支持，藥物研發各個研究階段應進行多學科間的整體綜合討論，信息相互反饋，相得益彰。藥物代謝動力學與各學科之間的關系愈加密切，對指導臨床安全合理用藥、預防不良反應，了解藥物相互作用以及從基因水平上正確指導藥物治療，具有重要意義。
報告下載：8021手性對映體色譜拆分及臨床前藥代動力學特性比較研究
本網收錄前沿Lab：軍事醫學科學院藥代動力學重點實驗室
相關鏈接：手性色譜柱的一些知識
多肽類藥物“截短型GLP-1”檢測方法相關關鍵性問題探索
最后由第二炮兵總醫院藥劑科李鵬飛老師跟大家一起探討了《多肽類藥物“截短型GLP-1”檢測方法相關關鍵性問題探索》的報告。
第二炮兵總醫院藥劑科 李鵬飛老師
討論的課題是一種多肽類藥物的藥代，以前嘗試用LC/MS方法做臨床前藥代，但是當時沒有成功，只得改用同位素標記的方法；由于今后臨床不能用標記的方法，仍需要繼續探索該藥物的非標記的、特異性方法。這里和大家討論，一是分享以前摸索的條件，另外也希望大家能提出一些更好的解決思路。編者注：多肽類藥物的藥代動力學研究是一個熱點，也是一個難點。
研究的對象是sGLP-1（截斷型胰高血糖素樣肽-1），26肽（m/z 2843 Da），它是一種用于治療II型糖尿病的降糖藥。研究證實，它與人體內自身分泌的GLP-1具有同源性且分子量更小，機體不易產生免疫反應，使用更加安全。主要用于Ⅱ型糖尿病的治療，特別是胰島素對抗或應用磺酰脲類降糖藥無效的患者，對正常血糖不起作用，因而不引起低血糖。
但sGLP-1不適宜用熒光、ELISA方法做藥代，所以，主要考慮用HPLC或HPLC/MS方法。
研究的目的是：
1、建立sGLP-1的檢測方法；
2、進行藥代動力學和毒代動力學研究：包括：基本闡明其在大鼠和猴體內吸收、分布、代謝、排泄的特征；為臨床前毒理學研究提供理論依據，并為臨床研究提供參考數據。
一、建立HPLC方法
由于26肽分子量較大，多肽還具有空間結構，用LC/MS方法準確定量潛在難度會較大；所以首先建立HPLC定量方法，并且對樣品溶解、穩定性、前處理等方面考察。
1、樣品的溶解：探索了6種方法，考察是否溶解、溶解后是否穩定、溶解后在HPLC、LC/MS上有好的響應？該藥物據委托方說有空間結構，在水里的pH約為3左右，在緩沖體系里能保持空間結構，離開緩沖體系則不能保持。最后選用的溶解方法是：0.01M NaOH溶液溶解樣品后，再用0.1M HCl調節PH至5.7的方法。雖然通用的溶解方法，大家希望選用跟后來的流動相（比如乙睛/水）兼容的方法，但是對于這種有空間結構的多肽類藥物，僅僅摸索溶解過程，就著實花了不少時間。比如，雖然PBS也能溶，但由于不適用于LC/MS，所以，后來也放棄了。當然，在場做蛋白質組學研究的一些用戶也提出了一些建設性的意見。
2、建立標準品的定量工作曲線：用HPLC、紫外215nm，流動相為添加0.85‰～1‰ TFA的乙睛/水體系，標準品的響應是符合要求的，1.25～75μg/ml，每個濃度進5針，R2=0.9996。
3、考察標準液放置的穩定性：分別考察標準溶液在25℃、4℃、-12℃下，新配、24h、48h、72h、一周、兩周、一個月的穩定性，測量結果為與原始濃度（50μl/mL）的偏差(%)，證明配置的溶液可在4℃保持兩周以上，-12℃保持一個月以上的穩定性。這對于確保今后配置溶液的可靠性很重要，另外可穩定地保存（偏差<15%）也證實了第1步中選用的溶解方法是合適的。
4、前處理方法：
a）首先用超濾方法分離提取，采用了Millipore公司的YM-30與YM-10超濾器從生物樣本中進行提取分離，觀察12.5μg/ml 標準品溶液分別通過YM-30和YM-10兩種超濾器過后的色譜圖，但結果不理想：過濾后樣品回收率低。超濾器的濾膜為低結合非勻質可再生親水纖維素膜，可能是由于此膜對藥物分子有較多的吸附，而導致的回收率低。當然，在場的老師也提到可試用另一種不是平底的、而是V型的超濾器，會減少對樣品的吸附。
b）考慮SPE固相萃取方法，分別一步步地選擇活化液、淋洗液、洗脫液，最后確定了流程，并可達到75％的回收率。在生物樣品基質的選擇中，血漿存在干擾，所以，最終選擇了血清。
c）考察藥物在生物樣品中穩定性：標準品加入血清中室溫放置1小時后提取測定，與立即提取無差別。
d）進樣穩定性：提取生物樣品后立即進樣、 2小時、4小時后分別重復進樣，三次測定結果無顯著性差異，說明進樣過程中樣品穩定。
50 μg/ml生物樣品萃取液相色譜圖（基質為血清）
二、建立靈敏度更高的方法——LC/MS/MS
多肽類藥物的給藥劑量很小，所以必須建立靈敏度高的特異方法，比如要把前面的ug/mL的檢測濃度降低到ng/mL級。一個考慮就是LC/MS/MS液相色譜-串聯質譜檢測法。
在HPLC方法的基礎上，用LC/MS/MS串聯四極桿質譜儀，分別從質譜參數的優化、色譜條件的優化、生物基質中sGLP-1的提取分離方法這幾個方面介紹了HPLC-MS/MS的檢測過程。
1、優化質譜參數
選用10μg/mL sGLP-1標準溶液，逐一優化質譜參數，確定母離子質荷比m/z為948.8（帶三電荷），二級碎片離子m/z為934.2（定量）和917.2（定性）。
2、優化液相條件，建立標準曲線
a）選擇柱子
比較A、B、C三根柱子的響應，保留了A、C柱子繼續優化梯度。
測試峰面積與濃度進行1/x加權線性回歸計算標準曲線（LC/MS/MS，標準溶液）
b）優化梯度和流速
最后選擇了C柱：Zorbax SB-C18柱（4.6×250 mm I.D.，5 μm粒徑，300?孔徑），經梯度條件的優化后最后確定流速為0.5 mL/min。
c）定量曲線
初步用優化的條件做1ng/mL～100 ng/mL的曲線，但低點不好，估計是容器（普通的塑料內套管）對藥物的吸附作用，所以最后選用了Agilent 100 μL帶聚合物支腳的聚丙烯內插管 。 最后建立了較好的標準品定量曲線：連續三天測定，在1~500 ng/mL的濃度范圍內，線性較好。
3、探索前處理方法
在前面液相色譜分析的基礎上，對質譜檢測中樣品的前處理方法進行研究，但結果不理想。因為質譜的靈敏度高，內源性物質的影響就變得非常顯著，所以不論選用乙腈或甲醇為沉淀劑的蛋白沉淀法，還是固相萃取法，都在空白血漿（或全血）的藥物出峰位置有明顯干擾。回收率也比較低。
李老師對實驗遇到的各種具體問題還進行了多個方面的分析。但是最關心的當然是：內源性干擾、回收率較低。多肽藥代動力學研究很有意義，雖然臨床前該藥的具體藥動實驗是用同位素標記法做的，但繼續開發非標記的特異、靈敏的方法是今后臨床實驗中必須要做的。
到場的同行們提了很多建議，做過其它多肽藥動方法的同行也抒發了同感。舉幾個建議如下：
編者注：生物基質中的多肽藥物的藥代動力學研究是一個難點，據了解，目前不僅實驗室在不斷致力于開發新方法，很多公司也在進行該項研究。比如在線的多維SPE系統、進一步增強前處理或分析儀器的選擇性、回收率等。
報告下載：多肽類藥物“截短型GLP-1”檢測方法相關關鍵性問題探索
本網收錄前沿Lab：第二炮兵總醫院分析中心
活動后，新參加的用戶、其它媒體的朋友對“質譜沙龍”的活動評價是：
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