質譜沙龍第三十八期活動報道

　　2013年5月19日，第三十八期質譜沙龍活動在航天中心醫院報告廳如期舉行。來自北京朝陽醫院、航天中心醫院、北京大學人民醫院、 空軍總醫院、北京天壇醫院、北京理工大學、北京腫瘤醫院、AB SCIEX公司、北京艾米諾醫學研究有限公司等質譜領域的專家、學者、技術工程師參加了本次沙龍活動。本次沙龍圍繞生物等效性、新藥臨床前藥代動力學、LC-MS/MS在藥物監測中的應用等當面展開討論，與會者暢所欲言，受益匪淺。

第三十八期質譜沙龍活動現場

　　活動伊始，質譜沙龍主辦者來自北京朝陽醫院醫學研究中心的李鵬飛老師介紹到：質譜沙龍活動已獲批北京市繼續教育項目“質譜沙龍-質譜技術在醫院臨床藥學科研中的應用，編號：2013-13-01-003（京）”，2013年計劃舉辦質譜沙龍交流活動4次，共計I類學分10分。希望今后能夠有更多的學者關注并參與質譜沙龍活動。

航天中心醫院臨床藥理室 張丹老師

　　首先，來自航天中心醫院臨床藥理室的張丹老師為大家詳細介紹了題為《生物等效性實驗室中的生物分析》報告。大量類別藥品的開發和評價都會涉及到生物等效性（Bioequivalence，BE）實驗，其中藥物新劑型、仿制藥等在完成BE實驗之后便可上市。目前我國藥品質量一致性評價中也更多關注到BE實驗，這些導致BE實驗在藥品研發和評價中占據十分重要的地位。

　　生物等效性實驗的分析方法包括藥代動力學方法、藥效動力學方法、臨床比較實驗方法、體外研究方法，其中藥代動力學成為首選的分析方法，該方法采用藥物制劑人體生物利用度原理，即測定不同時間點的生物樣本（全血、血清、血漿、尿液）中的藥物濃度，得出會與吸收程度與速度相關的藥代動力學參數，并進行統計分析，最后判斷兩個制劑之間是否等效。因此生物分析對BE實驗起到舉足輕重的作用，其結果將直接影響BE實驗的質量和結果。報告中，張老師所在實驗室依據國內外指導原則結合實際工作，針對BE實驗中的生物分析的幾個關鍵問題進行分析研究，分別從分析物和分析方法這兩大方面進行了具體的介紹。

　　BE實驗中的分析物的確定及其影響因素

　　在分析物方面，張老師又分別介紹了BE實驗中分析物如何確定以及相關的注意事項。不同于一般的PK研究，BE實驗分析物確定的基本原則是該分析物的靈敏度足以區分兩種試劑的吸收速度和吸收程度的差異。接下來，張老師分三部分詳細講解了BE實驗中分析物應如何確定：（1）母藥vs代謝物；（2）外消旋體vs 對映體；（3）多組分藥物生物等效性分析，以及分析確定會遇到哪些影響因素。

　　母藥vs代謝物

　　母藥的C_max能夠更靈敏的顯示出兩種制劑吸收速度的差異，因此無論母藥是否有活性，都應該選擇先測定母藥。此外，當母藥為前體藥物時，該藥物在體內的藥時曲線因為血藥濃度過低，或消除太快造成不完整的情況下，這時需要測定的是活性代謝物。如遇到母藥和代謝物都有活性的情況下，此時應該測定的則為母藥和主要活性的代謝物，但主要以母藥的BE統計和評價為準，代謝物作為支持。

　　外消旋體vs 對映體

　　即選擇非手性還是手性分析方法。EMA指導原則中指出通常可以采用非手性的分析方法，但不推薦。但當對映體同時滿足具有不同的PK、不同的PD，以及體內暴露量受到吸收速度影響這三個條件時，則需要對每一個對映體采取手性的方法分析。如遇到其中一個對映體具有活性，另一個對映體無活性或活性較低，只需證明有活性的對映體的生物等效性即可。

　　美國FDA指導原則中推薦使用非手性方法進行BE實驗；但當同時滿足（1）不同PK、（2）不同PD、（3）至少其中一個對映體具有非線性吸收性質、（4）在體內暴露量較低的對映體對藥效和安全性啟決定性作用這四個條件時，必須采用手性的分析方法。

　　張老師所在實驗室經過多年的實際工作，得出對于手性藥物的BE實驗應采用手性分析方法；在不增加BE實驗結果風險性的情況下，當遇到兩個對映體之間沒有立體選擇性；或者沒有活性或活性較低的對映體在體內的暴露量較低時，可以采用非手性方法代替手性方法。

　　多組分藥物分析

　　FDA指導原則中指出多組分藥物分析中分析物的確定應選擇能夠靈敏的顯示吸收速度和吸收程度差異的標志化合物。該標志化合物要綜合其在制劑中的含量、在體內濃度水平的高低、及其活性的大小。我國SFDA指導原則中要求每個化合物均需分析檢測。

　　分析物確定的影響因素

　　即共存物質和共流出物質對分析物的確定。FDA和EMA指導原則中均指出分析時要考察同時存在的藥物是否對分析物造成影響。此外，在進行方法開發和方法確證時，確保使用的生物基質和采集樣本時的基質一致。以及現在比較熱門的溶血和高脂的基質對分析物確定的影響。報告中，張老師具體介紹了代謝物對分析物確證的影響。代謝物不一定共存在方法確證的生物樣本中，因此會給分析帶來很多困擾，例如交叉效應、源內裂解、轉化。張老師依次例舉了分析實例，介紹了如何處理代謝物在BE實驗中對分析物確證帶來的影響。

　　BE實驗分析方法的特殊性

　　最后，針對BE實驗的特殊性，張老師介紹了其分析方法。由于BE實驗中得出PK參數后需完成BE統計，進行方差分析。因此需要考慮試劑間的差異、周期間的差異、序列間的差異等。因此在BE實驗中，如果生物分析的不理想，勢必會成為方差分析誤差大小的來源。針對上述問題，張老師在報告中從分析檢測、分批處理問題、盲測和揭盲，復測和已測樣品再分析，以及異常值這五個當面介紹了BE實驗分析中應注意到的問題。

北京大學人民醫院藥劑科的副主任藥師 趙立波老師

　　來自北京大學人民醫院藥劑科的副主任藥師趙立波老師為大家帶來了題為《利用液質聯用技術研究黃酮類化合物對P-gp在中樞轉運HIV-蛋白酶抑制劑的影響》的報告。

　　由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS，艾滋病）已經成為威脅人類健康的最大傳染性疾病之一。據WHO報告：2010全世界存活HIV攜帶者及艾滋病患者共3400萬，新感染270萬，全年死亡180萬人。每天有超過7000人新發感染。中國CDC估計，截止至2011年底，我國存活HIV攜帶者及艾滋病患者約78萬人，全年新發感染者4.8萬人，死亡2.8萬人；目前我國面臨艾滋病發病和死亡的高峰期。據趙老師介紹，HIV蛋白酶抑制劑是治療HIV-1感染的一線藥物，但由于HIV-1頻繁變異，單藥耐藥和多藥交叉耐藥發生率較高，導致HIV-1病毒（尤其是腦內的病毒）清除不徹底。

　　黃酮類化合物對P-gp在中樞轉運HIV-蛋白酶抑制劑的影響

　　P-糖蛋白（P-gp）能夠抑制住血腦屏障上的活性外排轉運體，使得藥物被充分吸收。目前國內外學者已對大量P-gp抑制劑進行了較多研究工作，例如維拉帕米、酮康唑、PSC833等。但到目前為止，已經發現的P-gp抑制劑存在或抑制強度不夠、或毒性較大等原因，均難以應用于臨床。

　　針對上述問題，趙老師所在課題組提出試圖尋找一種合適的化合物可抑制人類腦部P-gp，作為抗HIV蛋白酶抑制劑的增敏劑。經研究發現，許多黃酮類化合物如鑠精、桑色素、異黃酮和黃酮醇等能夠抑制腸道P-gp，增加藥物的吸收。黃酮類化合物來源廣泛，廣泛分布在植物的根莖葉花及水果、茶葉中；毒性小或無毒，與人體具有良好的相容性；具有協同抗病毒活性，能夠作用于逆轉錄酶和整合酶；且具有增強機體免疫功能，刺激機體的免疫系統產生TNF、IFN、IL等細胞因子。因此趙老師課題組邊便開展了黃酮類化合物對P-gp在中樞轉運HIV-蛋白酶抑制劑的影響研究工作。

　　報告中，趙老師詳細介紹了該課題組（1）以蛋白酶抑制劑利托那韋為例，建立生物樣本中低濃度利托那韋濃度HPLC-MS/MS方法的建立；（2）在細胞模型篩選具有P-gp逆轉作用的黃酮類化合物；（3）在整體動物確定黃酮類化合物對利托那韋藥動學（主要是腦內分布）的影響；闡明黃酮類化合物對P-gp外排作用的影響及其分子機制；為開發高效低毒的P-gp逆轉劑（作為蛋白酶抑制劑曾敏劑）提供有價值的實驗和理論依據。

北京朝陽醫院藥學研究中心的主管藥師 李鵬飛老師

　　來自北京朝陽醫院藥學研究中心的主管藥師李鵬飛老師帶來了題為《LC-MS/MS定性和定量研究2種硝胺化合物》的報告。

　　硝胺類化合物主要用于推進劑中的氧化劑和高能單質炸藥，常見的有黑索金（環三亞甲基三硝胺）和奧克托金（環四亞甲基硝胺）兩種。硝胺類化合物可造成中樞神經系統毒性，引起功能性紊亂、器質性損傷；導致血液系統毒性，紅細胞、白細胞、骨髓損傷，引起高鐵蛋白血癥；導致肝臟毒性，引起急性肝損傷、干細胞壞死、過敏性肝炎；以及呼吸道毒性，引起窒息、肺水腫、化學性肺炎。

　　目前硝胺類化合物在體外定量方面研究較多，并形成一定成果，例如采用檢測管和檢測儀法測定空氣樣本；以及熒光法、LC-UV、GC、LC-MS、LC-MS/MS方法測定環境樣本，檢測限低至pg級。但硝胺化合物在體內的研究較少，因此李老師所在實驗室利用LC-MS/MS平臺，建立體內復雜生物基質中索金和奧克托金同時定量的分析方法，以及為臨床硝胺化合物中毒的早期預警及有效治療提供方法支持。

　　報告中，李老師具體介紹了硝胺化合物的質譜行為研究、建立硝胺化合物的體內LC-MS/MS定量檢測方法、硝胺化合物在大鼠體內的藥物代謝動力學研究、以及靜脈給予硝胺化合物后大鼠的病理組織學研究。

　　體內LC-MS/MS定量檢測方法

　　在體內LC-MS/MS定量檢測方法的建立研究中，李老師所在實驗室通過方法學特異性、精密度與準確性、標準曲線和定量限、提取回收率和基質效應、穩定性考察一整套方法學驗證后，得出硝胺化合物的體內LC-MS/MS定量檢測方法采用負離子離子化模式，流動相中不添加任何試劑，樣品前處理采用一步蛋白沉淀的方法。

　　藥物代謝動力學研究

　　藥物代謝動力學研究中，對RDX和HMX的CL值進行t檢驗，發現有顯著性差異（P<0.05），表明RDX和HMX在體內清除速率有差異；RDX靜脈注射的t1/2為324.68 min，HMX靜脈注射的t1/2為134.88 min，RDX比HMX消除慢。RDX和HMX的Vd值有顯著性差異（P<0.05），表明RDX和HMX迅速在體內分布，其中血液中分布比例較小，且HMX在血液中分布比例比RDX小。

　　最后，李老師表示該分析方法具備兩大創新：（1）國內首次建立硝胺化合物體內定量分析方法；（2）國內外首次將LC-MS/MS技術應用于硝胺化合物體內分析。并且該LC-MS/MS方法最低檢測限可達0.5ng/mL。

空軍總醫院藥學部主任藥師 梁貴鍵老師

　　來自空軍總醫院藥學部主任藥師梁貴鍵老師為大家帶來了《基于“科學?文化”雙視角和“液相色譜?質譜?藥品標準?體內分析”四維度初談“我的夢?中國夢”》的報告。報告伊始，梁老師通過自己幾十年的色譜分析工作，談及了自己對“科學?文化”在分析工作的一些體會和看法。并再次介紹了其提出的“二分五性三碼一譜”解決體內藥物快速分析的新策略。

　　目前建立藥物色譜分析方法仍處于反復摸索的偶然或然狀態，或借助單純形、窗口圖法、重疊分辨率法和均勻設計等優化方法。與其緊密相關的基礎性問題，至今未得到系統的研究。

　　要解決這樣的問題，必須全面掌握內源性物質和常用藥物的色譜行為以及預處理后被除去、純化和富集的數據和規律。藥物分析是高效液相色譜技術得到最廣泛應用的領域，在藥物HPLC分析中，國內外迄今還沒有一個基于實驗數值型數據庫或能對流動相組成、內標選擇和樣品預處理方法三者進行推薦和仿真模擬的專家系統。梁老師所在實驗室分析了300多種藥物的色譜行為，提出了“二分五性三碼一譜”解決體內藥物快速分析的新策略。

“二分五性三碼一譜”新策略

　　 “二分”從分析樣品性質上區分是藥品分析還是生物藥物分析，從藥物結構上分清被測藥物的酸堿性。“五性”即色譜性、檢測性(響應性)、穩定性、 回收性和商品性。“三碼”即色譜碼、檢測碼和回收碼。“一譜”即內源性干擾三維碼。該方法的意義和作用可概括為：二分定原則，五性選藥物，三碼找方法，一譜除干擾。

北京艾米諾醫學研究有限公司 蘇晶博士

　　來自北京艾米諾醫學研究有限公司的蘇晶博士介紹了題為《新藥臨床前藥代動力學研究》的報告。

　　臨床前藥代動力學研究可以獲得一些重要的藥動學參數，為設計和優化臨床研究給藥方案提供理論依據，了解藥效或毒性的靶器官，闡明藥效或毒性產生的物質基礎，對擬定解毒措施有極其重要的知道意義。

　　蘇晶博士闡述了臨床前藥代動力學的注意事項。實驗藥品選擇上應提供受試藥物的名稱、批號、來源、純度、保存條件及配制方法。實驗動物常選擇小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬和猴等。動物體內藥代動力學研究應設置至少三個劑量組，給藥途徑和方式應盡可能與臨床用藥一致。方法學考察中考慮藥物在血漿中在線性范圍內線性關系良好，精密度和準確度符合要求，提取回收率不低于80%，在室溫放置24h，-20℃凍藏45d、3次凍融循環和處理后的待測樣品在進樣器中（4℃）4h的穩定性均符合要求。

　　在此基礎上，蘇晶博士取雌雄各半的SD大鼠通過單劑量灌胃給藥和單劑量靜脈注射進行了大鼠生物利用度的研究，首次建立了大鼠血漿中藥物的LC-MS/MS分析測定方法，并將其成功應用于藥物單劑量口服給藥后在大鼠體內的藥代動力學研究。該方法專屬性強，且具有較高的靈敏度。藥物在一定劑量范圍內的藥物動力學過程具有線性特征。即使在高劑量給藥條件下，藥物仍能夠在動物體內正常代謝并順利消除。對于難溶性藥物，在水和乙醇中溶解度很低，嘗試以二甲胺（DMA），后稀釋在聚乙二醇和生理鹽水中（二甲胺：生理鹽水：PEG400=1:5:5，v/v/v）制成溶液劑給藥，獲得藥物在大鼠體內的生物利用度。而在反相色譜系統中存在很嚴重的拖尾現象，嘗試在水相中加入三乙胺，用磷酸調節水相pH值，乙腈-0.2%磷酸水溶液（含0.5%三乙胺）（69:31，v/v），峰型最好，與干擾物質分離度也較好。除此以外，在肺肝脾等器官中，均有較高濃度水平的藥物被檢出，該藥物在生物體內分布廣泛，十分有利于其藥理作用的發揮，在動物腦中亦檢測到藥物的存在，說明該藥物可透過血腦屏障。同時還利用HPLC-MS-MS技術鑒定了大鼠灌胃給藥血漿、膽汁、尿液和糞便樣品中原形藥物和代謝產物，對這些化合物進行了電噴霧離子化質譜分析（MSn，n1-2），推測了各個代謝物的化學結構。依據提取離子色譜圖中各質量數下對應色譜峰的絕對強度判斷出I相代謝氧化產物和II相代謝的葡萄糖醛酸結合產物為其最主要的代謝形式。

　　目前新藥藥代動力學研究中常使用HPLC/MS研究藥物的吸收階段，在藥物的分布和排泄研究中常使用HPLC-UV方法，在代謝階段研究常使用HPLC-MS/MS方法。

AB SCIEX公司亞太應用支持中心 黃江博士

　　來自AB SCIEX公司亞太應用支持中心的黃江博士帶來了題為《AB SCIEX質譜技術在臨床研究分析中的應用》報告。黃江博士主要介紹了LC/MS/MS在臨床研究分析的現狀和應用實例。

　　通過經濟上的考量、受實驗結果報告周期、樣品分析的具體需求和添加新檢測方法的能力等多因素推動， LC/MS/MS在臨床研究中的應用越來越廣泛。目前應用領域有TDM（臨床治療藥物監測）中免疫抑制劑、抗逆轉錄病毒、抗精神病藥物、抗驚厥、抗病毒、苯二氮的測定；IEM中脂肪酸、氧化障礙、氨基酸、有機酸障礙、血紅蛋白病、LSDs（溶酶體貯積癥）等的測定；生物標記物中類固醇、維生素D、同型半胱氨酸、乳清酸、膽汁酸、腫瘤標志物和T3/T4的測定；臨床有毒有害物質中一般未知物的篩選、藥物的濫用、止痛藥和Opiates的測定。AB SCIEX公司從事臨床研究領域應用長達10年之久，在全球臨床研究市場已安裝超過500套系統，已經建立許多完善的檢測試驗方法。黃江博士強調：將來，AB SCIEX公司將更加重視和承諾為客戶提供新產品的開發和技術支持，不斷和客戶一起合作開發新的應用方法。目前Mayo、ARUP、Quest、CDC、NIH、Kaiser實驗室都和AB SCIEX有合作。

　　AB SCIEX之所以有這么多合作來源于公司綜合質譜的強大優勢。AB SCIEX質譜系統包括第一流的硬件和簡單易用的軟件，結合客戶的實際需求建立專用的應用方案，使客戶能夠快速建立常規運作。AB SCIEX公司擁有適合食品和飲料、制藥、臨床和法醫、環境的綜合質譜產品系統。質譜系統配有獨特的Turbo V離子源，獨特的Curtain Gas氣簾器接口，獨特的LINAC線性離子加速碰撞室技術，獨特的QTRAP混合三重四極桿和離子阱技術，再加上臨床研究領域的iMethod Tests軟件，使得AB SCIEX質譜成為臨床研究領域的最有力工具。

　　黃江博士具體講解了質譜分析TDM、新生兒篩查、維生素D和類固醇、臨床毒物篩查的實驗實例。LC-MS/MS在免疫抑制劑測定中具有很多優勢。多種免疫抑制劑可以同時檢測和定量，只要少量樣品就可以得到高靈敏度結果，儀器選擇性好，在復雜基質中干擾小。選擇on-line樣品凈化，減少樣品前處理，能夠測定3-4個數量級濃度范圍。LC/MS/MS分析維生素D可以節省溶劑、分析范圍廣、不要求特異性，一針進樣可以同時分析多種成分，很可能取代免疫法成為類固醇類分析的主要方法。

　　最后黃江博士介紹了目前在國外AB SCIEX已經研發開展的臨床領域的人們新領域。在醫院有維生素D、尼古丁代謝物、生物標志物和臨床毒物篩查的檢測。在政府機構主要用于酒后駕車測定酒精代謝物，K2粉及其代謝物，興奮劑和抗抑郁劑的檢測。還有軍隊、飛行員的濫用藥物篩查領域。