新一代測序技術之三國時代(上):Illumina

【摘要】2005年454公司首推劃時代的新一代測序儀，從而引發了測序市場上454、Illumina、ABI等公司在新一代測序技術上的比拼高潮。也正是這種你追我趕，讓繪制人類全基因組圖譜由過去的耗費4.37億美元和13年時間，驟然縮短到如今SOLiD 3運行一次即獲得50GB可定位測序數據。新一代測序技術專題，將逐個為你解析Illumina、ABI、Roche（454）的新一代測序儀，并匯集世界各大基因組中心諸多牛人對新一代測序儀的選擇標準及使用反饋。

　　Illumina公司的新一代測序儀Genome Analyzer最早由Solexa公司研發，利用其ZL核心技術“DNA簇”和“可逆性末端終結（reversible terminator）”，實現自動化樣本制備及基因組數百萬個堿基大規模平行測序。Illumina公司于2007年花費6億美金的巨資收購了Solexa，就是為了促成Genome Analyzer的商品化。Genome Analyzer作為新一代測序技術平臺，具有高準確性，高通量，高靈敏度，和低運行成本等突出優勢，可以同時完成傳統基因組學研究（測序和注釋）以及功能基因組學 （基因表達及調控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。

　　Genome Analyzer自上市以來，已經為千人基因組計劃立下了赫赫戰功。今年早期，荷蘭科學家利用它首次繪出女性的基因組圖譜。而就在前兩周，《Nature》雜志上一連出現三個人類基因組圖譜：炎黃一號-第一個亞洲人圖譜；第一個癌癥病人圖譜；第一個非洲人圖譜。它們全是依賴Genome Analyzer完成的。嘩，一下就來仨！這和第一個人類基因組圖譜的13年形成了多么鮮明的對照。

　　根據去年底的數據，Genome Analyzer已售出約200臺，估計是市場占有率最廣的。前不久，華大基因再添置了12臺，準備放在香港和深圳的實驗室，至此華大基因已經有29臺Genome Analyzer。而著名的麻省理工學院和哈佛大學Broad研究院擁有47臺Illumina測序儀。眾多實驗室之所以選擇Illumina，看中的無疑是Genome Analyzer的高性價比。

　　上個月，Illumina將Genome Analyzer II升級到Genome Analyzer IIx，距年底實現單次運行獲得95 GB數據的宏偉目標又近了一步。Genome Analyzer IIx有兩個核心特征：其一是更大的試劑冷卻器，支持超過100個測序循環，進一步提升了系統的易用性和自動化；其二是全新的流動池支架，讓每輪運行所得的高質量數據增加20%。依靠系統軟件和試劑的改進，Genome Analyzer IIx現在能夠支持100 bp以上的配對末端讀長，并在每次運行中產生超過20 GB的高質量數據。

　　Genome Analyzer技術的基本原理：

　　1. 文庫制備

　　將基因組DNA打成幾百個堿基（或更短）的小片段，在片段的兩個末端加上接頭(adapter)。

　　2. 產生DNA簇

　　利用ZL的芯片，其表面連接有一層單鏈引物，DNA片段變成單鏈后通過與芯片表面的引物堿基互補被一端“固定”在芯片上。另外一端（5’或3’）隨機和附近的另外一個引物互補，也被“固定”住，形成“橋 (bridge) “。反復30輪擴增，每個單分子得到了1000倍擴增，成為單克隆DNA簇。DNA簇產生之后，擴增子被線性化，測序引物隨后雜交在目標區域一側的通用序列上。

　　3. 測序

　　Genome Analyzer系統應用了邊合成邊測序（Sequencing By Synthesis）的原理。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP。 這些核苷酸是“可逆終止子”，因為3’羥基末端帶有可化學切割的部分，它只容許每個循環摻入單個堿基。此時，用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團化學切割，恢復3'端粘性，繼續聚合第二個核苷酸。如此繼續下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統計每輪收集到的熒光信號結果，就可以得知每個模板DNA片段的序列。目前的配對末端讀長可達到2×50 bp，更長的讀長也能實現，但錯誤率會增高。讀長會受到多個引起信號衰減的因素所影響，如熒光標記的不完全切割。

　　4. 數據分析

　　自動讀取堿基，數據被轉移到自動分析通道進行二次分析。

技術優勢　

　　Genome Analyzer系統之所以如此暢銷，關鍵在于其技術上的優勢。

　　1. 可擴展的超高通量

　　Genome Analyzer系統目前每次運行后可獲得超過20 GB的高品質過濾數據。這個技術的可擴展性保證了更高的數據密度和輸出，能用更少的經費完成更復雜的項目。到今年底，通量還有望上升到95 GB，相當于人類基因組的30倍覆蓋度。

　　2. 需要樣品量少

　　Genome Analyzer系統需要的樣品量低至100ng，能應用在很多樣品有限的實驗（比如免疫沉淀、顯微切割等）中。這也是很多研究人員所考慮的因素。

　　3. 簡單、快速、自動化

　　Genome Analyzer系統提供了最簡單和簡潔的工作流程。即使是最小的實驗室也能像大型基因組中心一樣進行大規模的實驗。制備樣品文庫可以在幾小時內完成，一個星期內就能得到高精確度的數據。Cluster Station可以說是Genome Analyzer的核心。由獨立軟件控制的自動生成DNA簇的過程可以在5小時之內（30分鐘手工操作）完成。這個自動化的流程不需要進行Emulsion PCR，減少了手工操作誤差和污染可能性，也不需要機器人操作或潔凈室。快速的實驗流程使Genome Analyzer的能力增至最大，而自動化步移降低了項目的時間和費用。

　　4. 新穎的測序化學技術

　　Genome Analyzer通過合成測序來支持大規模并行測序。利用新穎的可逆熒光標記終止子，可以在DNA鏈延伸的過程中檢測單個堿基摻入。由于四個可逆終止子dNTP在每個測序循環都存在，自然的競爭減少了摻入的誤差。

　　5. 單個或配對末端支持

　　Genome Analyzer系統支持單個片段或配對末端文庫。文庫構建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間。制備基因組DNA的單個片段或配對末端文庫需要6個小時，只有3個小時需要手工操作。2×50個堿基或更長的讀長增加了比對基因組的能力，并拓展了在其他方面的應用。

　　然而，精明的用戶更看重的是性價比，這也是他們選擇Illumina的重要原因。Illumina的售價約為45萬美元，低于454 GS FLX的50萬和SOLiD系統的59萬（以上皆為美國的售價）。此外，運行成本也是一個關鍵因素。美國鳳凰城翻譯基因組學研究院（TGen）的主管David Duggan曾表示，當年購買新一代測序儀時，每次運行的費用就成為他下決定的主要因素。他最終選擇了Illumina Genome Analyzer，因為每輪的運行費用為3000-4000美元（2007年的數據），較為合理，而其他測序儀可能更高。當然，他也綜合考慮了通量、運行時間和樣品量。

　　弗吉尼亞聯邦大學的高原（音譯）博士認為：“Genome Analyzer的操作費用、易用性和可擴展性讓我實現了大規模基因組實驗。現在，我的小型實驗室正在進行過去只能在大型基因組中心才能完成的實驗。低樣品需求、簡單的流程、高質量的數據以及應用靈活性讓Illumina Genome Analyzer從其他高通量測序技術中脫穎而出。”

　　高原博士的話已經很好地總結了Genome Analyzer系統的特點，那我們就借用來作為本文的結語吧。