中科院：海洋生物cDNA分析

　　造礁石珊瑚為珊瑚礁生態系統中的框架生物, 研究其重要功能基因對于理解造礁石珊瑚對環境變化的響應有重要指示意義，近期來自中國科學院南海海洋研究所的研究人員提取了澄黃濱珊瑚(Porites lutea)的總RNA, 通過RT-RCR得到 cDNA, 并以 cDNA為模板設計引物進行 test PCR, 獲得大小為 254 bp的 ferritin基因cDNA序列，并由此展開了分析研究。

　　珊瑚礁生態系統具有極高的生物多樣性, 且對環境變化的響應極其靈敏, 其主要框架生物造礁石珊瑚屬于刺胞動物門。近年來, 隨著基因組學和蛋白質組學在造礁石珊瑚研究中的應用, 越來越多的學者開始從基因的角度來研究造礁石珊瑚。

　　在生物有機體中, 鐵是參與細胞代謝所必需的微量元素之一。鐵蛋白(ferritin)是廣泛存在于動物、植物和微生物體內的一種鐵儲存和生物礦化蛋白。鐵蛋白的表達水平很高, 而且其表達調控在維持機體鐵平衡中發揮著重要作用, 其結構在所有脊椎動物中高度保守。通常情況下, 一個鐵蛋白含 24 個不同比例的重型(H)和輕型(L)鏈亞基圍繞著中央腔以存儲鐵離子。H 和 L 亞基是由不同的基因編碼的, 它們在鐵蛋白質復合體中扮演著不同的角色。H 亞基憑借其亞鐵氧化酶的活性, 促進二價鐵向三價鐵轉換, 然后形成一個 ferric-oxyhydroxyphosphate 復合物, 而L亞基則協助鐵進入中央腔以及支持鐵蛋白復合物結構的穩定。

　　鐵蛋白高度保守的結構、生化特性和分布的廣泛性突出了它在生物體中的重要性, 然而, 珊瑚 ferritin 基因的相關研究較少,因而, 研究珊瑚 ferritin 基因在珊瑚發育過程、環境脅迫下的表達可提供非常有價值的信息。造礁石珊瑚內參基因的選擇也非常重要, 它們的表達量需要保持穩定, 對它們的功能和可變性進行研究, 不僅有利于發現變化顯著的基因和發展新的標記基因, 還能為后來者的研究提供很好的基礎。

　　近年來, 三亞鹿回頭海域珊瑚礁衰退嚴重, 澄黃濱珊瑚是該海域的優勢種之一。澄黃濱珊瑚對熱帶海洋環境有指示作用, 特別是其發育過程中一些重要功能基因的表達變化更是珊瑚分子生物學研究的重點, 功能基因表達變化與環境間的關系還有待研究，所以, 發展澄黃濱珊瑚功能基因作為指示環境變化和發育情況的標記基因非常重要。

　　在這篇文章中，研究人員提取了澄黃濱珊瑚(Porites lutea)的總RNA, 通過RT-RCR得到 cDNA, 并以 cDNA為模板設計引物進行 test PCR, 獲得大小為 254 bp的 ferritin基因cDNA序列。

　　分析表明, 該部分序列編碼了84個氨基酸, 其中包含一個亞鐵氧化酶活性功能區, 而該活性功能區又有一個鐵離子通道, 其與多孔鹿角珊瑚(Acropora millepora)的 ferritin基因相似度較高, 達 85%, 覆蓋度為 100%, 推測該基因序列在種內和種間都較保守, 已向GenBank 提交序列, 并獲得登錄號為 JQ305796. 該序列可用于實時定量 PCR 技術(qRT-PCR)及 cDNA末端快速擴增技術(RACE)等后續分子生物學研究。

　　珊瑚ferritin 基因是與珊瑚發育及珊瑚白化相關的重要功能基因, 研究表明, H 型 ferritin 在珊瑚發育各個時期的表達情況變化明顯, 在珊瑚的發育過程中發揮著重要作用, 而且 ferritin 基因還有抗氧化功能, 在珊瑚受到環境壓力時能發揮抗氧化作用。在哺乳動物、魚類和蝦類中, 鐵蛋白的表達可受病原體的刺激下的誘導, 表明它參與了其中的免疫反應, 迄今為止, 還沒有學者對鐵蛋白在珊瑚被病原體感染情況下, 其表達量的變化進行調查。本研究成功獲得澄黃濱珊瑚 ferritin 基因的部分序列, 對于用來作為監測環境變化對珊瑚影響的生物標記研究奠定了重要的基礎。

　　然而, 當前關于珊瑚 ferritin 基因表達差異的研究很少, 應當用 qRT-PCR 技術研究其在各個發育階段或環境脅迫下的表達情況, 再利用 RACE 等技術獲得該功能基因的全長, 進而研究其蛋白的結構和功能. 此外, 應該分析獲得理想的內參基因來提高qRT-PCR 的效率, 但找到一個有效的內參基因也不是一項簡單的工作, 大量的研究表明在不同生物個體及不同條件下, 一些常常被認為很保守的基因表達會時常變化. 對于一些共生生物如造礁石珊瑚, 蟲黃藻可能會干擾珊瑚基因表達的檢測, 所以選取的內參基因都應該只是在珊瑚中特異表達。

　　差異顯示反轉錄-PCR (DDRT-PCR)就有利于發展識別一些合適的內參基因, 該方法能很方便地檢測內參基因表達量的變化, 還能對它們的功能和可變性進行研究，在珊瑚基因表達研究中應用到的內參基因主要有 18S rRNA, 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和 β-肌動蛋白(β-actin)等, 而哪個更加適合做珊瑚的內參基因尚不可知。