新技術可高效誘導單克隆抗體

　　抗體藥物作為生物技術產業的關鍵驅動力，能安全有效地對癌癥、自身免疫病和感染性疾病等進行靶向治療，該藥物在2012年創下全球645.7億美元的銷售額，占生物制藥51.8%的份額。目前抗體藥物的市場需求量仍在攀升，預計到2015年，抗體藥物銷售額有望達980億美元左右。業內人士認為，隨著疾病譜變化，抗體藥物的黃金時代已經來到。

　　單抗藥物的作用靶點很重要的一部分是行使細胞功能必不可少的跨膜蛋白，包括多通道膜蛋白MMP(如G蛋白偶聯受體)和離子通道，這些蛋白也是診斷檢測的重要分析靶點。目前跨膜蛋白占據了40%以上的單抗藥物靶點，而成功被單抗藥物靶向結合的僅占少數。

　　多數MMP的抗體已用于商業用途，不過其中的絕大多數表現不佳，通常局限在Western blot等研究領域。而一些MMP的單克隆抗體在活細胞經流式細胞儀篩選和功能分析時具有用處，然而在制備過程中生成量少且難度和成本都很高。

　　膜蛋白功能受其三維結構支配，對于抗體而言，要想對細胞的生理效應施加影響必須結合在膜蛋白上，事實上膜蛋白中僅有胞外片段才適合抗體結合。從結構上看，由不連續片段(或環狀結構)構成的MMP胞外區域，是多段經細胞膜分隔的多肽序列，其復雜的三維結構在缺乏膜的情況下無法形成。

　　X射線晶體學研究表明，抗體結合位點(CDR)的“足跡”是一段面積約20X30埃的區域構成，圖一示意鼠源單抗藥物ADORA2A的結合位點和胞外區域的相對大小。ADORA2A足跡具有56個氨基酸構成的胞外面積，這足以接觸G蛋白偶聯受體的整個胞外片段(GPCR胞外的多肽片段處于50至 125個氨基酸之間)。

　　高性能抗體

　　為了研制針對MMP胞外片段的高性能抗體，研究人員必需對動物進行免疫接種并收集一些能識別膜蛋白結構(作為抗原足以接觸抗體同時具有高親和性)的抗體。值得注意的是，短的線性多肽抗原不能折疊成自然3維結構因而不能作為膜蛋白胞外區域的重要部分，此外，提純的完整膜蛋白即便包括完整的胞外區域也不能用于功能抗體的研發，因為其在缺少膜的支持下不能折疊成天然結構。

　　研究人員經常利用病毒樣顆粒(VLPs)和轉染細胞(表達特定的靶標分子)研制出 MMP抗體，但是這一方法面臨的問題是，其它非靶標蛋白的存在使得特定抗體分子的生成量極其低。為了改變可用抗體不足以及制造成本高的現狀，SDIX公司研制出新方法可生產針對MMP胞外區域的高性能抗體。

　　DNA免疫操作是新方法的核心，其誘導的抗體免疫要明顯強于VLP或轉染細胞誘導的。經研究，DNA免疫能夠在免疫動物細胞膜上合成高純度的MMP靶定分子，尤為重要的是，新表達的蛋白在其它外源分子沒有干擾的條件下刺激免疫系統高效地合成抗體。此外，由于MMP分子在哺乳動物細胞中表達，可繞開提純或蛋白失活等問題，這對于高度脆性和易失活的MMP分子而言是極其重要的。從技術流程上看，免疫接種后利用融合技術獲取雜交瘤細胞，并利用流式細胞儀高通量篩選那些表達MMP靶標分子的細胞。

　　單一抗原的多個抗體表位

　　為了驗證DNA免疫技術的有效性，研究人員研制出3種MMP分子(GPCRs CXCR4，ADORA2A和 CD20)的單克隆抗體。值得肯定的是，這項技術誘導出針對單一MMP分子的大量單克隆抗體(它們具有獨特的結合位點和潛在功能)，從雜交瘤細胞中分別篩選出93種CXCR4單抗、15種ADORA2A單抗以及51種CD20單抗。

　　對抗體基因序列的分析得出，抗體高度多樣化地應對3種MMP分子。93種CXCR4單抗中有75種有獨特序列，而15種ADORA2A單抗和51種CD20單抗中有獨特序列的分別是14和34種。

　　那些表達MMP突變基因的細胞經表位圖譜分析后也表現出多樣性。目前已知的CXCR4單抗主要結合在胞外的第二圓環，但是來自DNA免疫動物的CXCR4表現出8種不同的結合模式;同樣地，大多數現有的CD20單抗可分為2大類(利妥昔單抗樣和ofatumumab樣)，而來自DNA免疫動物的CD20單抗表現出9種已知的和未知的特點。DNA免疫過程中溫和的抗原遞呈方式可解釋表位模型的多樣化，而新發現的表位可能在傳統的蛋白免疫過程中被破壞掉。

　　來自DNA免疫動物的單克隆抗體可與現有的單抗藥物想媲美。在流式細胞試驗中，SDIX公司研制的單克隆抗體表現出高親和性和反應獨特性，其研制的所有 ADORA2A單抗在流式細胞試驗中反應強烈，而CXCR4和CD20的多種單克隆抗體要比現有基準抗體具有更高的親和性。