基因捕獲技術:創建人類單倍體細胞庫

　　日前，使用名為“基因捕獲”(gene trap)的技術，奧地利的研究人員建立了一個人類單倍體細胞庫，這個細胞庫匯集了3000 多種細胞系，每個細胞系都具有一種不同的突變基因。相關的研究論文發表在8月25日的Nature Methods雜志上。渥太華大學教授William Stanford說：“我認為這是一個相當有趣的資源，我想人們會支持它。它的作用看起來非常強大。”

　　利用這些單倍體細胞系可以極大地促進基因功能研究。由于這些細胞中只含有一組染色體，其它染色體上等位基因突變的影響可以被屏蔽。斯坦福大學教授Jan Carette說：“相比于其他的技術，完全的基因敲除(complete knockout)可以獲得更強大的表型。”人體細胞是二倍體，單倍體細胞系無法直接獲得，因此奧地利科學院分子醫學(CEMM)研究中心的 Sebastian Nijman和他的同事轉而對KBM7人體細胞系進行研究。

　　KBM7 來源于一名慢性粒細胞白血病患者，除8號染色體外其余染色體全部都單倍化。雖然這些細胞是單倍體，它們仍然能夠執行基本功能維持活力。“有些人認為，單倍體細胞是一些反常的細胞，但實際上，在細胞水平，單倍體與生命非常相容，”斯坦福大學教授Jan Carette表示。要構建每一種突變，研究人員用偏好于整合到活性轉錄的基因中的反轉錄病毒來感染細胞。Nijman認為“最終的結果是該基因幾乎完全被沉默，類似于進行了基因敲除” 。

　　每個突變株都包含一個 GFP 標記和一個獨特的遺傳條形碼，這樣可以便于該突變株從克隆混合物中被識別。這些克隆另一個優點是它們的突變是可逆的。“基因捕獲”載體的兩側是 loxP 序列。為這些細胞提供Cre重組酶，對loxP 進行切除，研究人員就可以去除被捕獲的基因，并恢復正常的蛋白質翻譯。

　　為了驗證他們的細胞庫，Nijman和他的同事們對他們創造的幾個克隆的特征進行了特征鑒定。例如，位于JAK-STAT信號轉導通路的一個JAK2 基因捕獲的克隆，通常顯示 STAT1 磷酸化水平降低。“雖然在意料之中，這是第一次利用完全失活的 JAK2 基因在人類細胞中證實這一點，” Nijman表示。

　　研究人員表示，從理論上講，這樣一個完整的覆蓋了所有包括編碼或非編碼基因的細胞庫，為系統地研究幾乎所有細胞過程，如細胞周期控制、代謝、耐藥或藥物敏感等所需的基因功能及作用提供了一個很好的平臺。到目前為止，該研究小組已經累計構建出了幾千個人類基因組突變體，這些突變體可以通過Haplogen 和 CeMM 合作得到。

　　分子健康科學研究所的Anton Wutz認為臨床研究人員將會尤其對這些克隆感興趣。細胞生物學家可以產生自己的突變細胞株，而臨床實驗條件缺乏、想要檢測患者突變的臨床醫生可以通過索取得到這些克隆進行檢測，以確定他們所看到的是真正的病因還是與疾病不相關的現象。

　　這些克隆也存在一些局限。特別是KBM7 細胞并不能表達所有的基因。將這種方法擴展到來源于不同器官的單倍體細胞，尤其是單倍體胚胎干細胞，將大大增加實用性。Nijman補充說他們的研究小組還在繼續擴大這一細胞庫，但由于所整合的載體是隨機的，產生新的細胞突變將越來越困難。如果結合其他方法，例如轉錄激活因子樣效應物(transcription activator-like effectors ，TALE)和RNA 引導性核酸酶( RNA-guided nucleases，RGNs)，基因捕獲技術或許可以幫助研究人員擴展細胞庫。

　　Nijman的細胞庫匯集了越來越多的技術，研究人員可以用它來更深入地了解人類基因組。制造人類基因組突變池，絕對是一件有前途的事情。

　　基因捕獲技術簡介

　　基因捕獲技術是目前最具應用前景的基因克隆方法之一。利用該技術建立的隨機插入突變的突變體文庫，可用于尋找、鑒定和研究大量未知功能和已知功能的活化基因，它是繼自然突變、物理突變和化學突變之后發展起來的新的分子生物學方法。

　　基因捕獲的方法酷似以報告基因為誘餌來捕獲基因。其基本過程是將一含報告基因的DNA 載體隨機插入基因組,從而產生內源基因失活突變,并通過報告基因的表達激活提示插入突變的存在,及突變內源基因表達特點。通過篩選得到的插入突變的ES 細胞克隆經囊胚注射轉化為基因突變動物模型,進而分析表型來研究突變基因功能。每一種ES 細胞克隆中含有不同的突變基因,在短期內可建立大量含不同基因突變的ES 細胞克隆庫。突變基因的序列可通過基于PCR 的一些方法鑒定,同時還可能發現一些在體內表達或不表達的新基因。

　　基因捕獲技術主要包括三種類型：

　　1.增強子捕獲載體

　　含有一個最小的啟動子和翻譯起始位點,當載體整合到順式增強子元件附近時,此增強子將調控報告基因的表達 。對報告基因在體內表達的ES 細胞系插入位點進行克隆鑒定發現插入位置鄰近編碼序列。關于增強子捕獲的誘變比率還未見報道,但插入的性質預示由增強子捕獲產生功能失活的突變比率較低, 因此,增強子捕獲載體在小鼠體系中未得到廣泛應用。

　　2.啟動子捕獲載體

　　通常由不含啟動子成分的報告基因和一篩選標記基因組成,只有當載體插入到內源基因編碼區序列中產生融合轉錄本時報告基因才可能表達 。因而啟動子捕獲的致突變比率很高。然而載體插入到外顯子的頻率非常低,捕獲效率較增強子捕獲至少低200倍。故載體中通常含有一個篩選標記基因,如新霉素抗性基因( neo) 或β-半乳糖苷酶(galactosidase) 與neo 的融合基因(β-GEO) ,保證載體插入的細胞克隆被篩選保留。由于插入發生在DNA 轉錄區,克隆插入位點就可確定突變基因。

　　3.基因捕獲載體

　　中在無啟動子序列的報告基因上游和下游分別含有剪接受體( splice acceptor ,SA) 和多聚腺苷酸加尾序列(polyA) ,當含有順式作用的啟動子和增強子元件被捕獲基因轉錄激活時,載體中SA 與內源基因剪接供體( splice donor ,SD) 作用產生上游內源基因編碼序列與報告基因融合轉錄本,使內源基因發生突變,同時報告基因的表達提示內源基因的表達特點。融合轉錄產物可作為克隆突變基因序列的模板。由于插入發生在內含子中,基因捕獲的效率較啟動子捕獲至少提高50 倍。然而選擇性剪接(alternative splicing) 的發生會導致低水平的野生型轉錄本產生而形成減效等位基因突變 。