新技術推動CRISPR、TALEN廣泛介導基因敲入

　　使用一種新型的基因敲入（knock-in）技術，來自日本的科學家們將外源基因有效地插入到了人類細胞和包括蠶及青蛙在內的動物模型中。這種策略不僅能夠在培養細胞中，還可以在各種生物體中普遍實現基因敲入。相關研究結果發布在近日的《自然通訊》（Nature Communications）雜志上。

　　當前TALENs 和CRISPR/Cas9等可編程核酸酶已被廣泛應用于基因工程中，用來實現基因敲除、基因敲入和各種染色體重排。基因敲入通常是通過共同導入可編程核酸酶和單鏈寡核苷酸或是包含左右同源臂的靶向載體，誘導同源重組（HR）依賴性的基因添加來實現。

　　盡管同源重組介導的基因敲入能夠精確插入大的DNA片段。構建靶向載體往往很費力，且在大多數培養細胞和生物體中同源重組活性都相對較低。這一問題為同源重組介導的基因敲入技術應用于生命科學領域設置了技術障礙。

　　與之相反，研究人員常常利用可編程核酸酶借助于微同源(microhomology)介導的末端連接(MMEJ)依賴性突變來實現基因破壞（gene disruption）。MMEJ是一種利用5–25

　　bp的微同源序列來介導易錯配的末端連接的DNA雙鏈斷裂修復機制。在細胞周期中，MMEJ修復是在G1 /早S期活躍，而同源重組則是在晚S/G2期活躍。

　　在這篇新文章中，來自廣島大學科學學院的Takashi Yamamoto教授及其同事Ken-ichi T. Suzuki博士、Tetsushi Sakuma博士、Masanobu Obara教授，以及日本國立農業科學研究所的Hideki Sezutsu教授引入了一種利用TALENs 和CRISPR/Cas9技術借助微同源介導末端連接來實現基因敲入的創新策略，他們將其命名為PITCh（精確整合到靶染色體，Precise Integration into Target Chromosome）系統。

　　研究人員證實，TALEN介導的PITCh能夠有效將外源供體DNA整合到人類細胞、蠶和青蛙染色體中的靶位點。隨后研究小組進一步證實，無需攜帶質粒骨架序列CRISPR/Cas9介導的PITCh可以應用于人類細胞中。

　　這一PITCh系統適用于各種應用，包括構建疾病模型細胞和動物用于藥物篩查和治療開發。此外，研究人員預計這一基因敲入技術將提高有用重組蛋白的生產效率，例如培養動物細胞中的制藥原料等。此外，這些策略還可以應用于蠶中生成功能性的重組蠶絲蛋白。該研究小組預計這一PITCh系統將提高基因組編輯技術在各種細胞和生物體中的應用，尤其是在那些因低的同源重組率而阻礙基因敲入的細胞和生物體中。