藏藥蕨麻多糖水解單糖的毛細管區帶電泳分離研究

夏　蓮1 ,2 ,3 , 孫志偉2 ,3 , 白新偉1 , 索有瑞2 , 尤進茂3 1 ,2
(1. 生命有機分析重點實驗室,曲阜師范大學化學與化工學院,山東曲阜273165 ;
2. 中國科學院西北高原生物研究所,青海西寧810001 ; 3. 中國科學院研究生院,北京100049)
摘　要:以12萘基232甲基252吡唑啉酮(NMP) 為柱前衍生試劑,探討了毛細管區帶電泳模式下對藏藥蕨麻多糖水解液中單糖的分離條件。實驗采用58. 5 cm ×50μm i. d. 毛細管(有效長度50 cm) ,55 mmol/ L 硼酸鹽緩沖溶液(p H = 9. 46) ,柱溫20 ℃,分離電壓22 kV ,進樣10 s。該法不加任何添加劑,9 種單糖可高效、快速基線分離,實現了對藏藥蕨麻多糖水解液中單糖的分離和定量分析,結果令人滿意。
關鍵詞:多糖;蕨麻;12萘基232甲基252吡唑啉酮;毛細管區帶電泳
中圖分類號:O657. 8 　　文獻標識碼:A 　　　文章編號:100626144 (2010) 0120025205
藏藥蕨麻( Potent i l l a anserina L . ) 屬青藏高原特有的經濟植物,為薔薇科委陵菜屬植物鵝絨委陵菜之膨大塊根,又叫“人參果”,屬多年生草本植物。蕨麻作為一種具有較高營養價值和醫療保健功能的藥食兩用植物,有著廣闊的開發應用前景[1 ] 。現代藥理學表明:蕨麻具有健脾胃、收斂止血、補血益氣、生津利痰之功效,主治脾虛腹瀉、貧血及營養不良等癥[223 ] 。另有報道蕨麻具有治療黃疸性及病毒性肝炎的功效[425 ] ,是一種常用藏藥及滋補佳品。據文獻記載,蕨麻中含有糅質、糖類、蛋白質、脂肪酸及委陵菜苷等成分[ 629 ] ,而對蕨麻多糖的研究相對較少。楊樺等[ 10 ] 從蕨麻中分離出多糖,并測定了總糖含量。陳靈然
等[11 ] 和張霞等[12 ] 分別進行了蕨麻多糖的藥理學活性研究。劉春蘭等[13 ] 用苯酚2硫酸法對蕨麻多糖的單糖組成進行了分析,但由于方法選擇性差,多數單糖組分無法檢出。
毛細管電泳以快速、高效、靈敏度高、所需樣品量少等優點被廣泛應用[14215 ] 。目前,毛細管電泳對糖的分析主要集中在單糖和寡糖的分離檢測。Suzuki 等[16 ] 提出了一種不同于還原氨化類型的衍生法,以12苯基232甲基252吡唑啉酮( PMP) 為衍生試劑,利用活潑碳(C24) 和還原糖的還原端之間的縮合反應進行糖類的測定。趙燕等[17 ] 以PMP 作為衍生試劑成功分離了八種單糖,并將該方法用于中藥大黃多糖(RTP)的單糖組成及其摩爾比的測定。本文以12萘基232甲基252吡唑啉酮(NMP) 作柱前衍生劑,采用水提取乙醇逐級沉淀法從蕨麻中提取多糖組分,經Savage 法脫蛋白后的多糖以三氟乙酸水解,所得單糖用NMP標記后,采用毛細管區帶電泳實現了各組分的分離和定量測定,為蕨麻多糖的開發應用提供了理論依據。
1 　實驗部分
1. 1 　儀器、試劑與材料
HP23D 毛細管電泳儀(美國,Agilent 公司) ,配備二極管陣列檢測器;58. 5 cm ×50μm i. d. 毛細管(有效長度50 cm ,河北省永年銳灃色譜器件有限公司) 。12萘基232甲基252吡唑啉酮(NMP) 由本實驗室合成[18 ] ;單糖標準品(美國, Sigma 公司) ;硼砂(分析純,徐州試劑二廠) ;其它試劑均為分析純;水為Milli2Q 超純水。
蕨麻植物樣品購自西寧市藥材市場,經中國科學院西北高原生物研究所藏藥中心周昌范研究員鑒定。
1. 2 　標準溶液的配制
準確稱取葡萄糖、半乳糖、甘露糖標準品各0. 0180 g ,阿拉伯糖、木糖各0. 0150 g ,鼠李糖、巖藻糖各0. 0164 g , 葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸各0. 0212 g ,用水溶解并定容至10 mL ,得到各單糖濃度均為0. 01mol/ L 的標準混合液。準確稱取NMP 0. 112 g ,用乙腈定容至10 mL ,其濃度為0. 05 mol/ L 。
1. 3 　蕨麻多糖的提取
取干燥、研細的蕨麻根粉20 g ,加200 mL 去離子水,90 ℃下超聲提取1 h ,抽濾,取上清液減壓濃縮至剛好有固體顆粒析出,加3 倍體積的95 %的乙醇,靜置24 h ,離心得沉淀物。所得沉淀物用60 mL 水溶解后,用氯仿2正丁醇(體積比4∶1) 萃取三次(脫蛋白) ;上清液加60 mL 乙醇放置24 h ,離心沉淀,所得沉淀物70 ℃烘干,得50 %乙醇沉淀的蕨麻粗多糖(P50) 170. 67 mg ;離心后的上清液補加80 mL 乙醇,放置24 h 后離心沉淀,沉淀物70 ℃烘干,得70 %乙醇沉淀的蕨麻粗多糖(P70) 18. 07 mg ;繼續在所得的上清液中加400 mL 乙醇,放置24 h 后離心沉淀,所得沉淀物70 ℃烘干,得90 %乙醇沉淀的蕨麻粗多糖(P90) 9. 33 mg。
分別取上述三種蕨麻粗多糖5 mg ,加2 mol/ L 的三氟乙酸1 mL ,封口后于110 ℃下水解8 h 放冷后N2 吹干,用水溶解并定容至1 mL 備用。
1. 4 　單糖的衍生
向2 mL 安瓿瓶中加入200μL NMP 乙腈溶液、20μL 單糖標準品混合液、20μL 17 %氨水,封口后于70 ℃水浴中反應35 min , 取出放冷后用氮氣吹干,加2 mL 乙腈2水(體積比為4∶1)溶解后進樣分析。衍生化反應見圖1 (以甘露糖為代表單糖) 。
1. 5 　分析方法
以不同濃度的硼砂緩沖溶液,在不同p H、電壓和溫度下,采用二極管陣列檢測(DAD) 分別對糖類衍生物進行測定。實驗前對緩沖溶液進行超聲脫氣5 min ,每次進樣之前,分別用0. 1 mol/ L NaOH溶液、超純水、硼酸鹽緩沖液沖洗毛細管柱5 min ,更換緩沖液時,需要分別沖洗10 min 。
2 　結果與討論
2. 1 　NMP 與PMP 紫外吸收
將NMP 與PMP 分別溶解在乙腈(ACN) 、甲醇(MeOH) 、乙醇( EtO H) 和四氫呋喃( THF) 中(濃度均為1. 0 ×10 - 5 mol/ L) ,在相同實驗條件下測得的NMP 與PMP 的最大紫外吸收和摩爾吸光系數見表1 。NMP 是在PMP 的基礎上用萘基取代苯基后的產物,萘基取代后的NMP 分子共軛體系加強,243 nm 波長處的摩爾吸光系數明顯增加,檢測靈敏度更高。
2. 2 　衍生化條件的選擇
NMP 與糖的衍生隨溶劑不同衍生化產率有顯著差異。實驗中分別選取ACN 、MeOH、THF 、N ,N2二甲基甲酰胺(DMF) 、二甲亞砜(DMSO) 作溶劑,對衍生產率進行了考察。結果表明,在DMF、DMSO 和ACN 中的衍生產率基本相同,均高于在MeO H 和THF 中的衍生產率。考慮到衍生液的后續處理,實驗中選用ACN 作溶劑。NMP 與糖的衍生化隨堿性催化劑的不同,導致不同的衍生化產率。林雪等[19 ] 改進了PMP 與單糖的衍生反應,用氨水代替NaOH作堿性催化劑,得到了滿意的結果。本實驗采用17 %氨水作為催化劑,可得到與NaOH作催化劑相同的效果,且反應產物可直接用氮氣吹干,從而簡化了衍生液的后續處理。衍生化產率隨溫度升高而提高, 超過70 ℃后衍生產率隨之降低, 實驗中選擇衍生化溫度為70 ℃, 衍生化時間35 min 。對衍生試劑用量的考察結果表明, 衍生試劑對總糖用量的摩爾數比達5 倍以上衍生產率恒定, 實驗選取衍生試劑用量為總糖量的5 倍。
2. 3 　毛細管電泳分離條件優化
本研究考察了碳酸鹽緩沖體系、磷酸鹽緩沖體系和硼酸鹽緩沖體系后,發現硼酸鹽緩沖體系對糖類衍生物的分離效果最好。緩沖溶液濃度的改變會造成電導的變化,從而引起峰形的前伸和拖尾,所以,選擇合適的硼酸鹽濃度對提高分離效果具有很重要的作用。實驗在固定其它條件的前提下考察了硼酸鹽濃度在40～65 mmol/ L 范圍內對糖類衍生物分離的影響,發現硼酸鹽濃度為55 mmol/ L 時分離效率較高,遷移時間較短。
溶液p H 的改變會影響溶質的遷移行為和引起電滲流的變化[20 ] ,從而影響分離。考察了不同p H 的緩沖溶液對分離的影響,發現p H = 9. 46 時分離效率最高,分離時間最短,分離度較高。溫度和電壓對糖類分離影響較小,為了防止溫度過高或電壓較高引起溫度過高產生較大的焦耳熱影響分離效果,實驗選擇溫度為20 ℃,電壓22 kV。單糖標準品衍生物的分離度、遷移時間、理論塔板數和選擇性見表2
2. 4 　重現性、線性回歸方程和檢出限
在相同毛細管電泳分離條件下,對100μmol/ L 糖類衍生物進行6 次平行分析, 保留時間和峰面積重復性見表2 , 遷移時間相對標準偏差(RSD) 小于0. 48 % , 峰面積的RSD 小于4. 8 %。在最優化條件下,在250～5μmol/ L 的范圍內,依據峰面積對單糖濃度進行線性回歸, 所得各單糖衍生物的線性回歸方程、相關系數和檢出限見表3 。各單糖衍生物的線性相關系數在0. 9980～0. 9998 之間, 檢出限(S/ N = 3) 在0. 85～2. 19μmol/ L 之間。
2. 5 　回收率
在蕨麻多糖水解液中分別加入10μL 濃度為1. 0 ×10 - 2 mol/ L 的單糖標準溶液, 按照上述方法進行衍生, 重復3 次所得的各單糖的回收率在94. 83 %～104. 8 %。
2. 6 　樣品測定
取1. 3 節中多糖水解液40μL 于2 mL 安焙瓶中,依次加入NMP 溶液150μL ,17 %氨水30μL ,封口后于70 ℃水浴衍生35 min ,冷卻后N2 吹干后,加水100μL 和乙腈400μL 溶解后進樣分析。蕨麻多糖水解單糖電泳分離見圖2 。經多次測量得單糖含量見表4 。
3 　結論
采用NMP 作為柱前衍生試劑,通過對衍生化條件和毛細管區帶電泳分離條件的優化,建立了靈敏、快速測定單糖的方法。實驗表明,藏藥蕨麻中含有九種單糖,其中以阿拉伯糖(Ara) 、半乳糖( Gal) 和半乳糖醛酸( GlcUA) 含量最高,葡萄糖( Glc) 、鼠李糖(Rha) 、葡萄糖醛酸( GlcUA) 含量居中,木糖(Xyl) 、甘露糖(Man) 、巖藻糖(Fuc) 含量相對較低,該方法可作為藏藥蕨麻中單糖組成測定的常規方法。本方法在藏藥蕨麻多糖測定中的成功應用,將為豐富植物資源的多糖藥物組成分析和質量控制提供新的研究方法。
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Separation of Derivatized Carbohydrates of
Potentil l a anserinaL .by
Capillary Zone Electrophoresis
XIA Lian1 ,2 ,3 , SUN Zhi2wei1 ,3 , BAI Xin2wei2 , SUO You2rui1 , YOU J in2mao 3 1 ,2
(1. N ort hwest Pl ateau I nst i t ute of B iology , t he Chi nese A ca demy of S ciences , X i ning810001 ;
2. Key L aboratory of L i f e2Org anic A nalysis of S han dong Province , Col lege of Chemist ry S cience ,
Qu f u N ormalUniversi t y ,Qu f u 273165 ;
3. Grad uateUniversi t y of Chi nese A cademy of S ciences ,Bei j i n g 100049)
Abstract :A simple and rapid met hod was developed for t he separation of derivatized carbohydrates ofPotent i l l a anserina L . using 12nap ht hyl232met hyl252pyrazolone ( NMP) as derivatization reagent bycapillary zone elect rophoresis. The detection was performed wit h diode array at 254 nm. A 58. 5 cm ×50μm i. d. (50 cm effective lengt h) untreated f used2silica capillary was used. The optimum conditions areas follows : 55 mmol/ L borate buffer (p H = 9. 46) , voltage 22 kV , column temperature at 20 ℃anddetection at 254 nm. The samples were atmosphericallyintroduced wit h an injection time of 10 s. Theresult s indicate t hat 9 NMP2derivatized carbohydrates achieve baseline resolution wit hin 16 min underthe proposed conditions. The Potent i l l a anserinaL .sample was al so analyzed under t he optimumconditions.
Keywords :Polysacchrides ; Potent i l l a anserina L . ; 12Nap ht hyl232met hyl252pyrazolone(NMP) ; Capillaryzone elect rophoresis