納米孔測序技術用于快速的病毒病原體的鑒定及進化研究

　　2014-2016年，西非暴發埃博拉疫情流行期間，進行了大量ELISA和基于RT-PCR的檢測，這些方法的檢測雖然簡易、便攜、快速，但由于病原體不斷進化，這些方法很快變得過時，并且還缺乏能在癥狀出現前檢測出病毒的方法。

　　使用傳統的測序技術雖然可以克服病原體不斷進化的問題，但這一技術只有在將樣品送至設有相關基礎設施的檢測點后才能實現。并且，這樣做還將進一步延長從采樣到獲得結果的時間，增加了管理負擔和管理復雜性，導致此類項目滋生諸多實際問題。

　　相比之下，實時、便攜的納米孔測序技術可大大提高病毒分析速度，據報告從采樣到獲得結果的時間不到6小時。圖1為埃博拉病毒不同檢測方法之間的比較。

圖1 埃博拉病毒的不同檢測方法與各自從采樣到獲得結果的相應時間表。該表根據早先發表的數據繪制。

研究案例一：RNA病毒基因組的快速測序

　　cDNA測序提供的靈敏度和PCR法相當，而直接RNA測序提供了最快的樣本到結果周轉時間——沒有擴增或逆轉錄偏差。

　　腸道病毒 (EV）是一種單鏈RNA病毒，每年可造成全球數百萬人感染。感染引起的臨床表現范圍很廣，可從良性咽喉痛到更為嚴重的情況，如支氣管炎和肺炎。

　　基于PCR的檢測是常規鑒定具有臨床價值的病毒最常用的方法，然而，病毒基因組中經常出現的點突變和重組事件有可能導致出現假陰性結果，且病毒培養通常需要5-10天——這大大延遲了拿到結果的時間。

　　瑞士伯爾尼大學的Alban Ramette博士及其小組用RNA直接測序的樣本制備方法，只用5.5個小時，快速鑒定出柯薩奇病毒病原體，而cDNA方法需要23個小時。為了進一步簡化該過程，研究人員從糞便樣品獲取了RNA直接測序的樣本，并且沒有預先行病毒培養。盡管樣本制備方法僅產生了140ng的RNA——與推薦的500ng起始量相差遠——但該小組根據11個讀長 (其長度通常大于1000個堿基）測序并組裝出了完整的柯薩奇病毒(Coxsackievirus）基因組。此外，研究顯示，一條含有7208個堿基的單一讀長幾乎覆蓋了整個基因組（與參照柯薩奇病毒基因組序列相比，僅在序列的5’和3’末端少了25和109個堿基)。

圖 2使用納米孔技術對從培養的柯薩奇病毒(Coxsackievirus）分離株中獲得的cDNA進行測序，在測序的幾分鐘內便達到了98.8％的序列一致性準確度，并且該一致性準確度值在長達16小時的進一步測序中未呈明顯提高。使用nanopolish工具處理在測序10分鐘內獲得的首批5-10,000讀長，能將該準確度提高到99.8％。圖片由瑞士伯爾尼大學的Alban Ramette博士提供。

研究案例二：了解大型DNA病毒的進化

　　證明了長讀長測序能夠對復雜的基因組動力學進行高分辨率的分析。這種類型的分析為明確確定串聯基因重復的序列內容，并準確識別這些基因重復內的變體提供了框架。

　　與其他雙鏈DNA（dsDNA）病毒一樣，牛痘病毒具有快速適應的能力，盡管其單核苷酸突變率相對較低（與單鏈DNA或RNA病毒相比)。之前對病毒的研究鑒定了出兩種會抑制宿主應對感染反應的蛋白質——E3L和K3L。根據猶他大學的研究小組的研究，短讀長測序平臺能提供在群體水平上了解H47R等位基因頻率以及K3L基因座上總體覆蓋度變化的信息；然而，它們不能在串聯重復序列中進行點突變的基因分型或鑒定拷貝數的變化。

　　為了了解病毒進化過程中產生的這些獨特的適應機制，美國猶他大學的研究小組轉向了由納米孔技術提供的、能夠跨越大型重復DNA區域的長序列讀長。結果顯示，盡管拷貝數的增加穩定在第10代（高達15拷貝)，H47R 的SNP累積則是由第10代的低頻率累積到第20代的近乎固定不變（圖3)。該研究小組還表明，兩種遺傳改變的組合對病毒適應性的增加要比單獨基因的改變增加得更多。該小組利用納米孔技術提出了一種dsDNA病毒進化的新方式，其中罕見的有利變體迅速固定在多個基因拷貝中。

圖 3 對于H47R等位基因，含有多個K3L基因拷貝的基因組迅速同源化，這意味著突變使得適應性增加。圖片由美國猶他大學的Thomas Sasani提供。

研究案例三：病毒病原體鑒定

　　使用納米孔測序6小時內完成宏基因組病毒鑒定。

　　宏基因組病原體的即時檢測技術將成為傳染病治療領域一項極具價值的檢測手段。Greninger等人證實，納米孔技術可很好解決這一需求。

　　研究者對2014年暴發于剛果的埃博拉出血熱病疫情的2份血樣進行了檢測，一份為2014年爆發于波多黎各的疫情中的基孔肯雅病 (CHIKV) 陽性血漿樣本，另一份為丙型肝炎 (HCV) 陽性血清樣本。血樣中病毒滴度的范圍為105-108拷貝/ml，僅利用納米孔讀長，對近乎完整 (90%) 的CHIKV病毒基因組完成了測序，其準確度極高，同源性達97-99%。各樣本的首個病原體讀長的檢測均在40分鐘的測序窗口期內完成 (圖4)。

圖4 臨床樣本中首個CHIKV讀長在6分鐘內完成測序，進入測序運行。圖片由美國加州大學舊金山醫學院Charles Chiu教授提供；選自發表于生物醫學中心的一篇文章中的圖片。