凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質

（一）原理 
凡鹽析所獲得的粗制蛋白質（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類，這類將影響以后的純化，所以純化前均應除去，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法，這兩種方法各有利弊。前者的優點是透析后析品終體積較小，但所需時間較長，且鹽不易除盡；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時間也短，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以，要根據具體情況選擇使用。前實驗中樣品體積較小，凝膠達濾后樣品體積不會太增加，所以選用凝膠過濾法。 

（二）試劑與器材 
（1）Sephadex G- 25。 
（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液。 
（3）奈氏（Nessler）試劑：于500ml錐形瓶內加入碘化鉀 150g，碘110g，汞150g及蒸餾水100ml。用力振蕩7～15min，至碘的棕色開始轉變時，混合液溫度升高，將此瓶浸于冷水內繼續振蕩，直到棕色的碘轉變為帶綠色的碘化鉀汞液為止。將上清液傾入2000ml量筒內，加蒸餾水至2000ml，混勻備用。 
（4）20%（W/V）磺基水楊酸溶液。 
（5）1.5cm×20cm層析柱。 
（6）黑、白比色磁盤。 

（三）操作 
（1）取層析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，關閉下端出口。將已經溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去，加入2倍體積的 0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并攪拌成懸浮液，然后灌注入柱，打開柱的下端出口，繼續加入攪勻的Sephadex G-25，使凝膠自然沉降高度到17cm左右，關閉出口。待凝膠柱形成后，在洗脫瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱，以平衡凝膠。 
（2）凝膠平衡后，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面，打開柱下口，控制流速讓IgG 樣品溶液慢慢浸入凝膠內。凝膠柱面上加一層的0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并用此緩沖液洗脫，控制流速為0.5ml/min左右。用試管收集洗脫液，每管10滴。 
（3）在開始收集洗脫液的同時檢查蛋白質是否已開始流出。為此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質出現，直到檢查不出白色沉淀時，停止收集洗脫液。 
（4）由經檢查含有蛋白質的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑，若呈現棕黃色沉淀說明它含有硫酸銨。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液，即為“脫鹽”后的 IgG。 
注意：在檢測時，用皮頭滴管吸取管中溶液后應及時洗凈，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。 

附：凝膠過濾法原理及基本操作 
1．原 理 
凝膠過濾（gel filtration），又稱為凝膠層析（gel chromatography）、分子篩過濾（molecular sieve filtration）、凝膠滲透層析（gel osmotic chromatography）等。它是20世紀 60年代發展起來的一種層析技術。其基本原理是利用被分離物質分子大小不同及固定相（凝膠）具有分子篩的特點，將被分離物質各成分按分子大小分開，達到分離的方法。 
凝膠是由膠體粒子構成的立體網狀結構。網眼里吸滿水后凝膠膨脹呈柔軟而富于彈性的半固體狀態。人工合成的凝膠網眼較均勻地分布在凝膠顆粒上有如篩眼，小于篩眼的物質分子均可通過，大于篩眼的物質分子則不能，故稱為“分子篩”。凝膠之所以能將不同分子的物質分開是因為當被分離物質的各成分通過凝膠時，小于篩眼的分子將完全滲入凝膠網眼，并隨著流動相的移動沿凝膠網眼孔道移動，從一個顆粒的網眼流出，又進入另一顆粒的網眼，如此連續下去，直到流過整個凝膠柱為止，因而流程長、阻力大、流速慢；大于篩眼的分子則完全被篩眼排阻而不能進入凝膠網眼，只能隨流動相沿凝膠顆粒的間隙流動，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出層析柱；小分子zui后流出。分子大小介于完全排阻不能進入或完全滲入凝膠篩眼之間的物質分子，則居中流出。這樣被分離物質即被按分子的大小分開。 
用于凝膠層析的凝膠均為人工合成的產品，主要有交聯葡聚糖（商品名為Sephadex）、瓊脂糖（商品名為 Sepharose）、聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio–gel）及具有一定網眼的細玻璃珠等和這些凝膠的衍生物。 
下面主要介紹葡聚糖凝膠，這是由葡萄糖的多聚物與1–氯– 2、3–環氧丙烷交連而成。環氧丙烷引入丙三醇基將鏈狀的多聚葡萄糖單位交聯起來，凝膠網眼的大小由多聚葡萄糖的分子和環氧丙烷的比例（交聯度）來控制。

葡聚糖具有較強的親水性，在水和電解質溶液中膨脹成為柔軟而富于彈性的凝膠，其吸水能力與葡聚糖凝膠的交聯度有密切關系。交聯度大的，孔徑小，吸水少，膨脹的程度小；交聯度小的，孔徑大，吸水多，膨脹的程度大。因此，葡聚糖凝膠孔徑的大小可以其吸水量的大小來表示，常以G–10至G–200號碼標記。G后面的數字是其吸水量（毫升水/克干膠）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量為2.5ml/2干膠。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、 G–100、G–150、G–200等型號。G–75以上的膠因吸水量大，膨脹后形態柔軟易變，統稱為軟膠。G–75以下的稱為硬膠。 
葡聚糖凝膠可分離的分子大小從幾百到數十萬。可根據被分離物質的分子大小及目的選擇使用。一般說Sephadex G–l0～15通常用于分離肽及“脫鹽”。 Sephadex G–75～200用以分離各類蛋白質。 
凝膠層析是一種物理分離法。葡聚糖凝膠基本上不帶電荷呈多惰性，不與被分離物質發生反應，所以分離的效果較好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羥基，能吸附少量蛋白質等被分離的物質。為了克服這個缺點，一般使用含有離子強度達0.08的NaCl等中性鹽緩沖液作洗脫液。 

2．操作 
（1）凝膠溶脹（水化） 商品葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠均為干燥顆粒。使用前必須水化溶脹。商品瓊脂糖凝膠呈懸浮膠體可直接用，玻璃球不用溶脹。 
凝膠溶脹有兩種方法：一種是將所需葡聚糖凝膠浸入蒸餾水中于室溫下溶脹；另一種 是置于沸水浴中溶脹。各種葡聚糖在上述溶脹方法中所需的時間見下表：

必須浸泡足夠的時間以使凝膠充分溶脹。兩種方法中，沸水浴溶脹不但節省時間，還可以殺滅凝膠中污染的細菌并排出網眼中氣體。 
凝膠溶脹后，需用蒸餾水洗滌幾次，每次應將沉降緩慢的細小顆粒隨水傾倒出去，以免在裝柱后產生阻塞現象，降低流速。洗后將凝膠浸泡在洗脫液中待用。 
一支層析柱中應該裝入的干膠量可以用下法推算：稱取1g所需型號的葡聚糖干膠，放在5ml量筒中，用室溫溶脹的方法充分溶脹，觀察溶脹后凝膠的體積。然后在層析柱中加水到所需柱床高度，將水倒出，量取柱床體積。根據1g干膠溶脹后的體積和所需柱床體積，即可推算出干膠的需要量。 

（2）裝柱 將層析劑裝入柱中進行層析的方法稱柱層析法。作層析用的柱子稱層析柱。層析柱有玻璃和透明塑料的兩種。柱子的一端為進口，另一端為出口，出口端底部有燒結玻璃砂板或尼龍布，能阻止層析劑流出，溶劑則可流過。如果沒有市售的層析柱，可以選用粗細均勻，長短合適的玻璃管，在兩端塞上合適的膠塞，膠塞中插人細玻璃管，在一端放一層尼龍布為出口，即可作為層析柱使用。層析柱的長短粗細根據實驗的目的而定，一般說來，凝膠層析時柱越長，分離效果越好。但柱過長，層析時間長，樣品易稀釋造成擴散，反而影響分離效果。柱的內徑不宜較細，直徑1cm以下的柱易發生“管壁效應”，即柱中部分的物質組分移動較快，管壁周圍的則移動較慢，造成分離混亂。當然柱的內徑也不宜過粗。 
凝膠層析中，在把小分子物質（mw<1 500），如無機或其他物質與大分子物質 （mw<20 000）分離時，層析柱的體積一般約為樣品的4–10倍，高度與直徑的比例為5：1至15：1之間。這類柱也稱為“脫鹽” 柱，常用網孔很小的凝膠如G–25。用以將生物大分子物質彼此分開的分級層析柱，體積應為樣品體積的25～100倍。柱長度與直徑的比例為 20：1～100：1。 
裝柱的操作過程如下：將層析柱垂直固定在支架上，打開柱下口開關。將溶脹好的凝膠放在燒杯中，使凝膠表面上的水層與凝膠體積相等。用玻璃棒攪勻凝膠液，順玻璃棒灌入柱內。此時柱下口一邊排水，上口一邊加入攪勻的凝膠，可見凝膠連續均勻地沉降，逐步形成凝膠柱。當到達所需凝膠柱高度時，立即關閉下口，待凝膠自然沉降形成凝膠柱床。凝膠柱床一般應離柱頂3~5cm，并覆蓋一層溶液。

灌注凝膠時要求將均勻的凝膠一直加到所需柱床高度，不能時斷時續，否則將出現分層或“紋路”等毛病。若中途出現這些現象，可以用玻璃棒將已形成的柱床逐步攪起，直至出毛病的部分再讓凝膠重新沉降或繼續加入攪勻的凝膠懸液。若在灌好膠后才發現“紋路”、分層等現象時，要重新裝柱，以免影響層析效果。在做大型的凝膠柱時，灌注的凝膠是否均勻往往從表面上看不出來。所以使用前應該用一些帶色的大分子物質如細胞色素C、血紅蛋白或的藍色葡聚糖 –2 000 （Blue dextran–2 000）通過凝膠柱，觀察形成的色斑帶是否整齊，若斑帶歪斜，應該重新裝柱，直至達到要求。 
剛從冰箱中取出的凝膠液，不能馬上用來灌柱，應平衡至室溫后再用，不然裝好的凝膠會產生大量的氣泡影響層析。 
在整個灌注凝膠的過程及使用中，凝膠柱面上一定要覆蓋著一層溶液，以免進入空氣。若進空氣再加入溶液時，凝膠柱中易形成氣泡。 
（3）平衡 裝好的凝膠柱，使用前應該用相當于柱床體積兩倍或更多的洗脫液流過凝膠柱，以壓實凝膠，稱為平衡。 

（4）上樣 將樣品加入到凝膠柱中，準備層析的過程稱上樣。上樣時，應該注意上樣量的多少、樣品的黏稠度及離子強度。這三個因素會影響到以后層析的效果。一般來說“脫鹽”層析時，上樣體積可為柱體積的10%～25%；生物大分子的分級分離，約為柱體積的1%～5%。樣品的黏稠度一般不宜大于洗脫液黏稠度的2倍以上，不然洗脫峰會變寬和歪斜。離子強度要達到0.08，以免產生特異性吸附。 
上樣操作：先打開層析柱的下口開關，放出凝膠柱面上的溶液，或用皮頭吸管吸取，使液面與凝膠表面相平齊，但切忌液面低于凝膠表面。然后將樣品加在凝膠表面，打開柱下口開關，控制流速，使樣品慢慢滲入凝膠內。加樣時注意勿將凝膠柱面沖起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免樣品沿柱壁與凝膠柱的間凝膠隙漏下。當慢慢滲入凝膠的樣品液液面與凝膠柱面相平時，關閉下口，完成上樣。然后在凝膠柱面上加一層（3～5cm）洗脫液，接上洗脫瓶準備洗脫。 

（5）洗脫 用規定的溶液流過樣品，使分子量不同的樣品逐步分開并先后由柱床流出的過程稱為洗脫。所用溶液稱洗脫液。洗脫液放在貯液瓶（洗脫瓶）中并與層析柱相通連。洗脫時只要打開層析柱下口開關，洗脫液即可流出。 
洗脫過程中保持恒定的流速是柱層析獲得良好分離效果的重要條件。因為凝膠層析的分離作用主要取決于分子擴散進入凝膠的機會，流速過快有些分子來不及在分子篩中分配而流出；過慢時已分離的分子會因擴散而混合。因而要保持適當的恒定流速。洗脫液的流速取決于它的靜水壓。靜水壓是指洗脫瓶中洗脫液的液面高出于層析柱出口產生的液體壓力（或接觸空氣的兩個液面間的高差），這個高度差越大，靜水壓越大，洗脫液的流速就越快。這個壓力差可以調動，如提高洗脫瓶的位置或瓶中液面的增減；或者降低或提高層析柱出口的位置等，因此靜水壓又稱操作壓。 
由于靜水壓越大，洗脫液的流速就越快。在固定洗脫瓶與出口位置的情況下，靜水壓會在洗脫過程中，隨著洗脫瓶中溶液減少液面不斷下降而減少，難以維持流速的恒定。為了解決這個問題，Marriotte將洗脫瓶加塞塞緊，塞中插入玻璃管，使玻管下口深入到洗脫液的底部，這樣洗脫液的靜水壓便等于此玻管下口的液面高出層析柱出口液面的高度（因為當洗脫瓶液體流出時，瓶頂形成真空，空氣只從玻璃管中進入，玻管下口即為接觸空氣點），因此只要溶液不低于玻璃管下口，玻璃管口以上溶液的增減將不影響靜水壓，從而自動保持了流速的恒定，此洗脫瓶稱為恒壓瓶，也叫馬氏瓶。當然，當洗脫液減少至液面低于玻管的下口時，便會失去作用，但這時可用及時加入洗脫液來解決。 
在凝膠層析中，不僅要保持靜水壓的恒定，還要保持適當的靜水壓。這是因為G–75以上的軟膠膠體柔軟易變形，對靜水壓僅有一定的承受能力，不同軟膠的承受能力也不相同，靜水壓超過凝膠的承受能力時，zui初流速會很快；其后隨著靜水壓力過大將使軟膠變形壓緊，流速逐漸降低，zui后甚至流不出。所以，保持恒定正確的靜水壓是凝膠層析時獲得滿意結果的必要條件。 
脫鹽一般使用的是G–25屬于硬膠，硬膠不易變形，受靜水壓的影響較小，實驗過程中的流速可用恒壓瓶下口橡皮管上的螺旋夾控制在0.5ml/min左右，隨著洗脫液的流出，樣品逐步被分開。用試管收集洗脫液，按順序每管收集2ml。 

（6）檢測 在收集的同時，檢查蛋白質是否流出。于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中（按編號順序），再分別加入1滴20%磺酰水揚酸，如出現白色沉淀即表示蛋白質已流出凝膠柱，如此一直檢查到蛋白質全流出為止。與此同時，再從蛋白質的管中取出1滴于白色比板中，加入奈氏試劑1滴，如蛋白管中不出現棕色，即表示蛋白質中的硫酸銨已除去。合并純化后的蛋白質管以待用。以光密度值為縱坐標，以收集管的順序號為橫坐標，在坐標紙上繪圖。可獲具有一條洗脫峰的曲線，稱為洗脫曲線，用以表示被分離物質流出的狀態。

（7）凝膠的洗滌及保存 由于凝膠對被分離的物質基本無吸附作用，所以無需“再生”，只要用洗脫液沖洗后即可連續使用。但因多次使用凝膠顆粒將逐漸沉積壓緊，流速將減慢，所以使用一段時間后應倒出來，清洗后重新裝柱。 
凝膠暫時不使用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室溫保存應加入0.02%疊氮鈉（NaN3）或0.01%乙酸gong等防腐劑，以防發霉。用時以水洗去防腐劑即可使用。凝膠長期不用，可用水洗凈，分次加入百分濃度遞增的乙醇溶液，每次停留一段時間，使之平衡，再換一下濃度的乙醇，讓凝膠逐步脫水，再用乙謎除乙醇，抽干即可，或將凝膠洗凈后抽干，在表面皿上30℃逐步烘干。