實驗方法原理 做透射電鏡觀察需進行切片、固定和包埋細胞過程,與一般組織切片法大體相似,其最大的難題是如何把細胞完整無損地從培養瓶皿壁上包埋下來。自從定型產品塑料薄膜問世后,這一困難已被克服。應用無菌塑料薄膜是極其理想的支持物,比用蓋玻片、微孔濾紙、云母和卵殼膜等支持物都好。把細胞直接培養在塑料薄膜上,不僅細胞生長效果好并可與細胞一起包埋切片,免除了很多麻煩。若利用其它材料不僅不利細胞生長,最大缺欠是在包埋前需把細胞從支持物上分離下來,增加了工作量。
實驗材料 細胞
試劑、試劑盒 戊二醛PBS醋酸異戊酯
儀器、耗材 玻璃瓶離心機顯微鏡
實驗步驟
一、透射觀察法
透射觀察必須切片,根據培養細胞種類和培養方法不同分原位切片和消化分離切片兩種。
1. 在用玻璃瓶培養細胞做透射觀察時,做原位切片非常復雜。只能采用消化法把細胞制成懸液才能進行包埋和切片。其過程為:消化分離細胞、固定、包埋、切片和觀察幾項。
進行消化時,應注意,消化液的濃度不宜太大、消化時間也要適度,吹打細胞動作要輕微,以防損害細胞表面的微細結構。然后低速離心,令細胞沉于離心管底部(用錐形離心管最好),吸除上清液,立即加戊二醛固定。其余包埋、切片等步驟與一般組織相同,請參閱其它電鏡技術,此不贅述。
2. 單層培養細胞通過消化分離細胞包埋法的優點是獲細胞數量多,便于進行包埋和切片。
缺點一是通過消化可能損傷細胞表面結構,二是消化改變了細胞單層生長時細胞相互接壤關系。
3. 也可采用原位包埋法,為此應把細胞培養在無菌聚苯乙烯塑料薄膜上,便于進行固定、包埋、切片處理。
聚苯乙烯薄膜是一種由聚苯乙烯制成的厚度類似蓋片、無毒、質地柔軟、已消毒包裝的成品(國內尚未見生產)。用時可剪切成適宜的小塊置入瓶中,然后再向瓶中接種細胞,待細胞附于蓋片上并生長后,取出、進行固定、剪切成小塊、直接包埋入Epon膠囊中,很易切片,是原位包埋透射電鏡觀察細胞理想的方法。
如觀察的為懸浮細胞,因懸浮細胞不必做消化處理,可直接進行離心、固定、包埋和切片,細胞保存效果好。
二、掃描觀察
培養細胞掃描觀察非常方便,在觀察貼壁細胞時也需進行消化,制備成細胞懸液后,用Hanks液漂洗1~2 次,除去細胞碎塊和血清蛋白等(以免妨礙觀察)。其余處理與血細胞掃描電鏡觀察法相同。
進行原位掃描觀察培養細胞更為容易,可按以下步驟進行:
1. 加支持物小蓋片培養法培養細胞,至指數增生期;
2. PBS pH7.4漂洗兩次,以去除培養液;
3. 25 %戊二醛/PBS固定30 分鐘;
4. PBS漂洗3 次;
5. 1 %OsO4固定45 分鐘;
6. PBS漂洗3 次;
7. 脫水
丙酮/醋酸異戊酯(1:1)10 分鐘→醋酸異戊酯30 分鐘;
8. 臨界點干燥;
9. 噴金;
10. 掃描電鏡觀察(Hitachs-450)、照像。