青島能源所基于pDEPRADS推出首臺高通量流式拉曼分選儀

　　單個細胞是生命活動的基本單元，也是生物進化的基本單位。因此單細胞技術正在推動生命起源、細胞功能異質性機制、生命暗物質挖掘與利用等領域的一系列重大突破。單細胞拉曼光譜（SCRS）能非標記、非侵入性、無損、全景式地揭示細胞代謝狀態，因此基于拉曼光譜的單細胞分選（Raman-Activated Cell Sorting，RACS），在單細胞技術體系中有著廣闊的應用前景（Biotechnol Adv，2019）。但是，拉曼譜圖采集時間長、分選通量低等問題，限制了RACS的廣泛應用。針對這些關鍵瓶頸，青島能源所單細胞中心發明了基于介電單細胞捕獲/釋放的拉曼激活液滴分選技術pDEP-RADS，并研制成功國內外首臺高通量流式拉曼分選儀產品樣機FlowRACS。利用FlowRACS，首次示范了基于分子光譜、非標記式、單細胞精度、高通量流式的酶活篩選，為酶資源的探測和挖掘開辟了一個全新的技術路線。該工作近日發表于《科學進展》（Science Advances）。

　　開發首臺高通量流式拉曼分選儀FlowRACS，服務高通量酶篩選

　　一個微生物細胞的體積通常只有一個人體細胞的千分之一。在高速液流中，針對這么微小的細胞，如何精確捕獲、采集高質量全譜拉曼并實現高通量分選，一直是業界的重點和難點。針對上述問題，青島能源所單細胞中心王喜先、辛一、任立輝等帶領的研究小組發明了“介電單細胞捕獲/釋放拉曼激活液滴分選技術”pDEP-RADS（Positive dielectrophoresis based Raman-activated droplet sorting；圖1）。通過周期性施加介電場，確保高速流動的單細胞被精確捕獲在拉曼激光位點，以允許高質量拉曼譜圖的采集；進而單細胞經液滴包裹，借助介電實現目標單細胞微液滴的高通量分選。

　　在此關鍵技術突破的基礎上，研究人員研制成功首臺高通量流式拉曼分選儀FlowRACS。研究人員采用低拉曼背景石英玻璃為微流控芯片基材，以提高表型檢測的普適性；以氧化銦錫（而非金屬）加工電極陣列，以避免光熱損傷；采用先拉曼檢測后液滴包裹、液滴產生和分選同步進行的策略，避免了液滴對拉曼信號采集的影響，從而提高檢測準確率并簡化系統操作；最后通過自主開發的QSpec軟件，實現了平臺的自動化運行。

　　新陳代謝是一切生命活動的基礎，而新陳代謝離不開酶的催化作用。因此，酶是最主要的生物資源之一，也是生物技術產業的重要載體。例如，甘油三酯（TAG）是人體、動物和植物中油脂的主要成分，它具有極高的能量存儲密度，而且在幾乎所有細胞中都存在，因此是自然界的“能量存儲貨幣”。細胞中TAG生物合成的最后一步和限速步驟，是二酰基甘油酰基轉移酶（DGATs）。自然界中DGATs的功能極其多樣，其活性不僅調控TAG產物的合成效率，還控制著其飽和度、碳鏈長度等；這些理化性質決定了TAG的用途和經濟價值，例如是適合做營養品還是生物燃油。因此，作為油脂分子設計的關鍵工具，DGATs 的挖掘和篩選具有重大的科學意義和應用價值。

　　但是，傳統的DGATs篩選方法通常包括候選酶基因在底盤細胞中的表達、細胞擴增培養以積累足夠生物質、從生物質中提取并通過薄層層析法分離TAG產物、用氣相和液相質譜來分析和定量TAG中組分等繁雜步驟。這一流程通常需要一周時間，既耗時耗力，而且難以分析生長緩慢或尚難培養的細胞。業界也嘗試用尼羅紅等熒光染料來標記細胞中油脂，然后通過流式細胞熒光分選儀（FACS）分選細胞，但是熒光染料特異性低、難以定量分析、細胞壁對染料的通透性低或不可控、油脂飽和度無法表征等瓶頸問題仍然沒有解決。

圖1 單細胞中心研制的pDEP-RADS技術及儀器系統

　　針對這些瓶頸問題，單細胞中心“另辟蹊徑”，提出了利用以拉曼為代表的分子光譜來篩選酶促反應活性的新思路。利用FlowRACS，單細胞中心首次在單個微生物細胞精度，實現了DGATs（在人體、動物和植物中催化油脂的合成）體內活性的非標記式、高通量、高準確率、無損分選。針對來源于微擬球藻的候選DGAT基因庫，僅通過為時僅10分鐘的FlowRACS運行，就成功獲得3個已報道的強效基因和2個從未報道過的弱效基因。而前期基于傳統方法對這3個強功能基因的篩選和表征，歷時長達數月時間。

　　與基于生物質提取和質譜分析的胞內油脂分析方法相比，FlowRACS的篩選時間、試劑耗材和人工成本僅為其百分之一，大大提高了酶的篩選效率。與FACS相比，FlowRACS不再需要針對酶的底物或產物進行熒光標記，可同時定量表征油脂含量和飽和度等多種關鍵的酶活指標，而且具有更高的檢測靈敏度和更寬的動態范圍。此外，能夠熒光標記的底盤細胞很有限，而FlowRACS適用于任何細胞，這一特色對于從菌群等尚難培養微生物中直接挖掘酶和細胞工廠等生物資源來說，具有特別重要的意義。

　　突破國產科學儀器產業化瓶頸，推動原創高端生命科學儀器產業發展

　　近年來，在科研人員的努力與國家政策的支持下，我國高端科學儀器研制取得了積極的進展，但是僅僅是“追趕”和“并行”的發展方式并不能夠從根本上扭轉高端儀器依賴進口的現狀。放眼中國各大科研院所、高校和企業研發中心的實驗室，進口儀器、尤其是高端進口儀器仍然占據著數量與經費的絕對優勢。一旦遭遇國外的技術封鎖，我國的科學研究將遭遇無源之水、無米之炊的窘境，科技發展將面臨前所未有的困局。

　　然而，科學儀器產業卻是我國科技鏈條的最短板之一。全球科學儀器公司20強中，國產儀器公司無一上榜。2019年美國儀器行業巨頭賽默飛、丹納赫、安捷倫的全年收入分別達到255.4億美元、179.1億美元和51.6億美元，而排名最靠前的國產儀器廠商同期營業收入僅僅為7.34億美元。與此同時，2020年全球單細胞分析市場規模估計為26.8億美元，預計在2019至2026年以16.9%的年復合增長率增長，國內市場規模預計35億人民幣。強大的市場需求以及市場占有率狹小的局面，對國產單細胞分析儀器的研制和產業化提出了巨大的挑戰，同時也帶來了前所未有的機遇。

　　基于pDEP-RADS技術，單細胞中心推出了國內外首臺全譜分選通量達到600個細胞/分鐘的高通量流式拉曼分選儀產品樣機FlowRACS。FlowRACS具有完全自主的知識產權，已于今年6月份完成了現場技術驗收。單細胞中心長期致力于微生物單細胞技術和裝備的研制和產業化，前期已經陸續研制成功并產業化臨床單細胞拉曼藥敏快檢儀（CAST-R）、單細胞拉曼分選-測序耦合系統（RACS-Seq）、積木式單細胞微液滴快速顯微分選系統（EasySort）等單細胞分析儀器系列產品。做為該儀器系列的最新成員，FlowRACS的研制成功和應用拓展，將為單細胞科學與產業提供一個全新的研究工具，并推動我國細胞科學高端儀器產業的自主創新。

　　上述工作由單細胞中心馬波研究員和徐健研究員主持完成，并得到了國家合成生物學重點研發計劃、國家重大科學儀器研制項目、山東能源研究院、青島星賽生物科技有限公司等的支持。

　　附錄：

　　Xixian Wang#, Yi Xin#, Lihui Ren#, Zheng Sun, Pengfei Zhu, Yuetong Ji, Chunyu Li, Jian Xu*, and Bo Ma*, Positive dielectrophoresis based Raman-activated droplet sorting for culture-free and label-free screening of enzyme function in vivo, Sci. Adv, 2020, DOI: 10.1126/sciadv.abb3521

　　Yuehui He#, Xixian Wang#, Bo Ma*, Jian Xu*, Ramanome Technology Platform for Label-free Screening and Sorting of Microbial Cell Factories at Single-cell Resolution. Biotechnol. Adv, 2019, DOI: 10.1016/j.biotechadv.2019.04.010.