可以參考如何做RNA電泳實驗,RNA容易降解所以操作中有很多要注意的細節。。。
實驗基本原理
RNA可以使用非變性或變性凝膠電泳進行檢測。在非變性電泳中,可以分離混合物中不同分子量的RNA分子,凡是無法確定分子量。只有在變性情況下,RNA分子完全伸展,其泳動率才與分子量成正比。
判斷RNA提取物的完整性是進行電泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的電泳圖譜應可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三條帶,且28s rRNA的亮度應為18s rRNA的兩倍。
實驗試劑
1、0.1%DEPC水:200ml雙蒸去離子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混勻,室溫放置過夜,高壓滅菌。
2、10x電泳緩沖液:嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)0.4mol/L(pH 7.0);NaAc 0.1mol/L;乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L;
3、50mL變性瓊脂糖凝膠(1%):10x電泳緩沖液5 mL;瓊脂糖0.5 g;0.1%DEPC水36.5 mL;加熱溶解,稍冷卻,加入8.5 ml 37%甲醛。
4、上樣緩沖液:50%甘油,1mmol/LEDTA,0.4% 溴酚蘭,0.4%二甲苯藍。
5、甲酰胺(去離子)。
操作步驟
1、將制膠用具用70%乙醇沖洗一遍,晾干備用。
2、制膠:稱取0.5g瓊脂糖粉末,加入放有36.5mL的DEPC水的錐形瓶中,加熱使瓊脂糖完全溶解。稍冷卻后加入5ml的10x電泳緩沖液、8.5ml的甲醛。然后在膠槽中灌制凝膠,插好梳子,水平放置待凝固后使用。
3、加樣:在一個潔凈的小離心管中混合以下試劑:電泳緩沖液(10x)2μl、甲醛3.5ml、甲酰胺10ml、RNA樣品3.5μl。混勻,置60℃保溫10min,冰上速冷。加入3μl的上樣緩沖液混勻,取適量加樣于凝膠點樣孔內。同時點RNA標準樣品。
4、電泳:打開電泳儀,穩壓7.5V/cm電泳。
5、電泳結束后通過紫外透視儀觀察。
注意事項
本實驗中必須保持RNase污染以免RNA降解。所有試劑用DEPC水配制,用具也用DEPC水沖洗,并滅菌。