scaleX生物反應器系統在慢病毒和腺病毒載體生產中...1

我們之前在Pall iCELLis?固定床生物反應器中，以小規模和商品化規模，進行了病毒載體（慢病毒、腺病毒以及腺相關病毒）的生產。最近，一家名為Univercells的比利時公司推出了一種新型固定床生物反應器，其具有相同的細胞生長表面基質材料，但固定床結構與iCELLis生物反應器所使用的結構不同。我們嘗試對這種新型scale-X hydro生物反應器（2.4m2）和iCELLis Nano系統（2.67m2）進行一對一比較，以了解這種差別對細胞生長及慢病毒載體或腺病毒載體產量的影響。實驗運行使用在iCELLisNano生物反應器中針對病毒載體生產而優化的參數進行。細胞生長通過細胞核計數以及跟蹤葡萄糖消耗和乳酸產生來監測。在兩種生物反應器系統中，細胞生長良好，且發現scale-X生物反應器中細胞分布相當均勻。結果證實，在慢病毒載體和腺病毒載體生產中，Univercells的scale-X生物反應器至少可獲得同等效率，甚至更優化。基于這些結果，用于iCELLis生物反應器中病毒載體生產的相同程序和參數也可成功用于scale-X生物反應器系統中的生產。
 
簡介
用于基因治療的病毒載體仍主要以貼壁細胞生產。標準的小規模生產依賴于不同的培養瓶方法，而規模放大選擇有，例如Cell Factories（細胞工廠，ThermoFisher Scientific）或Hyperstacks（Corning）。但是，這些方法需要大量的人工操作，可能需要開放式連接，且不能監測或控制pH、溶氧等。所以，需要用于貼壁細胞的大規模、可拋棄型生物反應器。ATMI/Pall在十多年前推出了iCELLis固定床生物反應器。iCELLis Nano生物反應器的三維固定床由數百根13.9 cm2的小尺寸聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）纖維（“載體”）組成，其裝填在生物反應器內。iCELLis生物反應器提供高（144g/L）和低（96g/L）兩種壓縮結構。iCELLis Nano生物反應器的培養面積可達4.2m2，對于小規模批次來說，是非常有用的工具，但其主要用于工藝開發和優化。iCELLis 500是商品化規模系統，根據固定床高度和載體壓縮程度，其培養面積范圍為66 – 500m2。我們是最早將iCELLis技術用于基于HEK293(T)貼壁系統，以進行腺病毒、慢病毒和腺相關病毒（AAV）載體生產工藝的團隊之一。工藝開發在iCELLis Nano生物反應器上進行，然后工藝規模放大至iCELLis 500規模，目前，我們已在iCELLis 500中生產了用于臨床試驗的病毒載體物料。我們每個批次可生產>1x10^16腺病毒顆粒。其它團隊也發現iCELLis生物反應器可有效用于逆轉錄病毒、AAV、狂犬、甲肝以及基孔肯雅疫苗的生產，或以昆蟲細胞生產重組蛋白。iCELLis 500生物反應器是一種符合GMP要求、完全可拋棄且可控的系統，并具有灌流能力。系統支持貼壁細胞生長和高滴度生產。
 
基于對iCELLis系統的專業知識，我們自然對Univercells新近推出的貼壁生物反應器深感興趣。Univercells的scale-X生物反應器系統是一種自動化及一次性使用固定床生物反應器，其培養面積范圍為2.4m2（商品名為hydro）至600m2（nitro）及以上。Univercells附有10-30m2“中型尺寸”scale-X carbo生物反應器系統。到2020年，所有的scale-X生物反應器可用于GMP生產。系統適合，例如，體外使用，特別是當產量要求低于直接將病毒載體注入患者體內所需要求時。系統的固定床材料與iCELLis固定床相同，但是結構不同。iCELLis固定床使用微載體相對隨機的填充，而在scale-X生物反應器中，固定床是5cm2寬度的剛性聚丙烯篩網條帶和非編織親水性聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）織物交替螺旋管式組成的雙層的均一結構，層間由間隔網隔開。這種結構可在整個固定床中實現更好、更均勻的細胞分布。除了病毒載體生產外，scale-X生物反應器系統也可實現連續的在線濃度，因為系統可選擇內置中空纖維切向流過濾模塊。通過將scale-X生物反應器與NevoLine微型工廠結合，使用用于生物反應器和在線下游處理的鏈式封閉柜體，可降低GMP設施要求。我們測試將這種新型scale-X hydro生物反應器系統用于慢病毒和腺病毒載體生產，以確定不同的膜基質裝置是否會影響細胞生長或病毒載體產量，并將系統與iCELLis生物反應器進行了比較。兩種生物反應器系統使用此前在iCELLis生物反應器上優化的相同參數。結果發現，在兩種生物反應器中，細胞生長相似。Scale-X hydro生物反應器中的產量至少與iCELLis Nano系統中的產量相當。
  
材料和方法
  
細胞系和培養基
 
293T（ATCC，Manassas，VA）和HEK293（ATCC）細胞培養在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS，Gibco）以及50-100 U/mL青霉素、50-100μg/mL鏈霉素（Gibco）和4mML-谷氨酰胺（Gibco）的高-或低-葡萄糖DMEM培養基（Gibco，Paisley，United Kingdom/Sigma-Aldrich，Irvine，United Kingdom）中進行，用于慢病毒載體和腺病毒載體生產。此外，在慢病毒載體生產中，轉染后（PT）培養基補充1x非基本氨基酸（Gibco）、1mM 丙酮酸鈉（Gibco）以及1:500 CD-脂質添加物（Gibco）。FBS包含在生物反應器接種前、細胞擴增時的起始培養基中以及直到轉染后24h的生物反應器運行中，之后的運行不添加FBS。接種密度7,000 – 9,000 cells/cm2。接種前，所有細胞培養在+37℃、5%CO2濕化環境的T型瓶中。
 
用于慢病毒載體感染性滴度分析的HeLa細胞（ATCC）培養在DMEM-10%FBS（Gibco）-50U/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素（Gibco）中。轉導時不含FBS。
 
iCELLis Nano和scale-Xhydro生物反應器中的慢病毒載體生產
 
總共進行4個scale-X生物反應器運行。在3個運行中，生產慢病毒載體，另1個運行中，在轉染前，按Univercells提供的指導，對生物反應器進行拆解，以分析固定床不同區域的細胞密度。一個iCELLis Nano生物反應器作為對照，平行運行。
 
iCELLis Nano中的慢病毒載體生產使用2.67m2低壓縮固定床生物反應器（Pall Life Sciences，Hoegaarden，Belgium）。在scale-X生物反應器運行中，使用Univercells（Gosselies，Belgium）的2.4m2 scale-X hydro生物反應器。運行按此前描述進行，使用灌流維持目標0.5g/L葡萄糖。葡萄糖和乳酸每天檢測1次或2次（Cedex-Bio，Roche，Mannheim，Germany）。接種后的1h，生物反應器培養基取樣，對非貼壁的細胞進行計數。按此前報導，在第1-4天，對iCELLis Nano生物反應器中貼附到載體的細胞進行細胞核計數。在scale-X hydro生物反應器中，膜層間有采樣條（與iCELLis Nano生物反應器中的載體尺寸大致相同），可與iCELLis Nano系統相似地進行取樣和細胞核計數。對于每個細胞核計數，使用無菌鑷子取兩根采樣條。此外，1個scale-X生物反應器固定床拆解，對固定床頂部（距離頂部邊緣1cm）、中部和底物（距離底部邊緣1cm）、兩個膜層以及固定床的外、中和內表面進行細胞核計數（圖1）。對于細胞核計數，從膜上裁1cm2小片。
 
在所有運行中，以1:1的DNA：PEIpro比例和200 ng/cm2質粒（PlasmidFactory Bielefeld，Germany），使用PEIpro（Polyplus-transfection，Illkirch，France）–介導轉染，生產三代LV-GFP。轉染按此前描述進行。
 
開始收獲前，進行完整的培養基置換，轉染后24– 72h，在室溫條件下，通過收集灌流培養基，收獲病毒載體。運行結束時，生物反應器排放至相應的收集袋中。
 
iCELLis Nano和scale-Xhydro生物反應器中的腺病毒載體生產
 
總共進行了兩個生物反應器運行，一個使用scale-X生物反應器，一個使用iCELLis Nano系統，以比較腺病毒載體生產的差異。除與慢病毒運行一樣，通過灌流控制目標0.5g/L葡萄糖外，運行按此前描述進行。細胞接種密度為7,000 cells/cm2,。與慢病毒運行相似地，葡萄糖和乳酸每天檢測2次（Cedex-Bio），第1-4天進行細胞核計數。感染按之前描述進行，兩個生物反應器使用相同的腺病毒載體（Ad-GFP）數量（平均感染復數值為75）。感染后68h，使用基于去垢劑的裂解方法進行細胞裂解。收獲物料使用0.027 m2深層濾器（Millipore，Billerica，MA）澄清。

 

圖1. 拆解的Univercells scale-X hydro生物反應器的細胞技術。從頂部（a）和側面（b）觀察的scale-X 生物反應器示意圖。淡灰和深灰點指示用于細胞密度分析的取樣點。淡灰=內側膜的取樣，深灰=外側膜層的取樣。對于細胞密度分析，對固定床頂部、中部和底物、卷膜的外表面、中部以及內表面進行細胞核計數。示意圖下方表格中所示為細胞密度（cells/cm2）。

分析
 
慢病毒載體的感染性滴度（轉導單位[TU]/mL）使用基于定量聚合酶鏈式反應（qPCR）的方法確定。慢病毒載體顆粒（vp）滴度通過將p24酶聯免疫吸附分析（ELISA；PerkinElmer，Waltham，MA）的pg/mL結果轉換為vp/mL來分析，假定p24的1pg為12,500慢病毒顆粒。腺病毒載體顆粒滴度使用高效液相色譜（HPLC）分析。
 
結果和討論
 
ATMI/Pall大約在10年前推出了第一款全整合式、可拋棄型固定床生物反應器iCELLis。此外，市面上也有一些其它公司開發的貼壁生物反應器，如Celligen（NewBrunswick Scientific）、CellCube（Costar）、裝填床生物反應器（BioBLU，Eppendorf）以及基于微載體的生物反應器。在最近的創新產品中，還包括Univercells生產的scale-X生物反應器，該公司由JoseCastillo聯合創立，他也是iCELLis系統的發明者之一。我們的團隊對于使用iCELLis生物反應器進行病毒載體生產具有豐富的經驗。由于iCELLis和scale-X生物反應器中，用于細胞貼附的膜采用相同的材質，我們假設在iCELLis生物反應器中優化和使用的參數可相當簡單地轉移到scale-X生物反應器。為測試這種假設，我們比較了scale-X生物反應器和iCELLis Nano系統中的細胞生長、細胞分布、培養基消耗以及慢病毒和腺病毒載體生產。
 
細胞分布 
 
我們之前比較了iCELLis Nano生物反應器高壓縮固定床（4m2）和低壓縮固定床（2.67m2）中的細胞分布，發現在低壓縮中，細胞分布更加均衡。在高壓縮固定床中，細胞分布有較大的差異，取決于計數的細胞來自哪一層（相比頂部，底部的細胞量要高3到4倍）。盡管在低壓縮固定床中，差異性較小，我們還是注意到，相比底部，低壓縮床中部的細胞量要高2到3倍。對拆卸的scale-X生物反應器進行了細胞密度分析，以了解固定床不同部分中的細胞分布（圖1）。結果發現，在整個固定床中，細胞分布相比均衡（圖1）。但是，當垂直或水平分析時，固定床中部的細胞密度要高約2倍，這與低壓縮iCELLis生物反應器中的結果較為接近。當對雙層膜的外膜和內膜進行細胞密度分析時，發現差異很小。這可能是由于scale-X生物反應器固定床的卷式膜樣結構形成了批次間細胞密度以及細胞生長更低的變異性。相比scale-X生物反應器，iCELLis生物反應器中，特別是在高壓縮固定床中，細胞密度更高的變異性，可能是由于載體相對隨機且緊實的填充。所以，在iCELLis生物反應器中，由于存在一些低致密和高致密區域，每個反應器之間總是有差異。
  
此外，在拆解前，對拆解的生物反應器的采樣條進行取樣，計算密度為~1.1x10^5cells/cm2，接近膜頂-中部的密度（1.2x10^5±0.4x10^4）。所以，可見scale-X生物反應器中的采樣條具有代表性，可用于評估細胞密度。