色譜柱維護保養心得

如何清洗和保存反相色譜柱？怎樣處理新買來的色譜柱？用水來沖洗色譜柱有什么后果？分析結束后如何沖洗？這些問題是HPLC分析人員常常要面對的。本文就這些問題介紹一些色譜柱的維護和保養經驗。

新色譜柱的處理

對于新購買的色譜柱，首先應該做些什么呢？幾乎所有的色譜柱在出廠時都保存在它們測試時的溶劑中，通常是60%~80%的甲醇-水，這與在反相色譜中使用的流動相是兼容的，所以可以直接轉換到所要使用的流動相。另外，也可以先用20~30ml流動相中的強溶劑甲醇、乙腈或者四氫呋喃沖洗色譜柱，然后再轉換到所需流動相。需注意的是，在沖洗或平衡色譜柱時，重要的是溶劑的體積而不是沖洗時間。提高流速可以縮短沖洗平衡的時間。

如果使用有機溶劑和水或者緩沖液，10倍柱體積的流動相可以使色譜柱達到沖洗平衡。如果流動相使用離子對試劑，則需20~50倍柱體積的流動相。對于直徑4.6mm的色譜柱，其柱體積可按下式估算：

Vm ≈ 0.1 L

其中，Vm 為柱體積（ml），L 為色譜柱的長度（cm）。故一個15cm × 4.6mm 色譜柱大概的柱體積為1.5ml。直徑為2.1mm的色譜柱的柱體積大約為4.6mm的20%，所以5cm ×2.1mm的色譜柱含溶劑為100μL。

對于B型高純硅膠基質填料的色譜柱，色譜柱的再現性很規范，這與15年前普遍使用的、不是很純的A型硅膠基質填料的色譜柱形成鮮明對比，但很多用來分析產品和原料的“流傳”下來的HPLC方法仍沿用這種色譜柱。有的時候，新的色譜柱需要運行幾針分析樣品才能使保留時間和峰面積保持穩定。這種情況對于新型的色譜柱比較少見，但仍需一段時間的磨合。有時可以通過運行高濃度的樣品或對照品來加速最初的色譜柱平衡。例如，如果你看到運行了幾針50ng的對照品，其保留時間和峰面積有所漂移，試一試運行1μg的對照品，然后再運行50ng的對照品。這種方法常常可以加速柱平衡的時間。

用水沖洗色譜柱

我們常常會被問到這樣一些問題：“我的樣品是水溶性的，流動相中含有緩沖液和甲醇，我不能用水來沖洗所有水溶性的污染物嗎？”回答是：“不可以”。用水沖洗C8或C18色譜柱有兩個缺點，第一，這些色譜柱一般不能與100%水匹配。第二，樣品一般總是溶于乙腈和甲醇。

 用一個不是很恰當的比喻，C18的填料看起來像許多網球，C18鏈則像一些絨毛附在填料的表面。這些填料像一些所有表面都在顆粒內部的一塊含有6~15nm直徑小孔的海綿。C18鏈的表面與固定相鍵合在小孔的里面，一小部分裸露在固定相填料的表面，所以這些小孔是非常疏水性的。在正常的操作中，水-有機溶劑流動相進入小孔中且完全潤濕固定相。分析物的分子分布于細孔的內外，并通過與固定相的相互作用被保留在色譜柱上。當流動相被水替代后，水分散到小孔中，那么，有機相被水稀釋了，可是水的極性太大了，以至于不能滲透到鍵合相，不能很好地起到沖洗固定相的作用。當所有的有機相從小孔中被趕走以后，相對于鍵合固定相，流動相（100%水）極性太大了，它會被推出小孔外，這些在非極性顆粒表面凝結的小水滴就像在停車場里一個油點上的水珠。這種現象發生的時候，即使你用一天的時間沖洗，色譜柱也不會得到清潔。同時，當有機相重新加入的時候，則需要更長的柱平衡時間。

這種從色譜柱填料細孔中將水排斥出去的過程稱為“去濕化”。過去我們稱之為“固定相坍塌”，其實固定相沒有真的坍塌，只是它把水從固定相顆粒的細孔中排出在外。有些色譜柱可以被100%水沖洗，而不會被去濕化。這些色譜柱中嵌入了極性固定相，有時稱之為“AQ”柱或與水匹配的色譜柱，由于色譜柱中含有足夠的極性固定相，所以可以使用100%水。

更好的沖洗方法

比較好的沖洗色譜柱的方法是首先用水替代流動相中的緩沖液，例如，用60:40的乙腈-水替代60:40的乙腈-緩沖液，然后沖洗5~10ml，即可將大多數的緩沖液沖洗干凈。然后再轉換到100%的有機相，在這種情況下是乙腈。進一步沖洗10~20倍柱體積，即可將強保留的污染物從色譜柱上沖洗下來。色譜柱可以保存在這種有機溶劑中，裝在LC系統上或取下來塞上端塞保存都可以。以上沖洗程序適用于所有反相色譜柱，不論是C8、C18，還是苯基、氰基或其他極性鍵合色譜柱。

一開始使用不含緩沖鹽的溶劑來沖洗色譜柱或許不是所有方法必需的，但它卻是可以采用的一個很好的預防措施，尤其是對于流動相中含有的緩沖鹽，如磷酸鹽。例如，不可以從30:70的乙腈-20mM磷酸鹽緩沖液直接轉換到100%乙腈中，因為磷酸鹽會在泵或色譜柱中沉淀下來。

如果流動相或色譜柱中含有緩沖鹽，不要關閉LC系統超過一個小時以上，當系統閑置的時候，如果有機相揮發，緩沖鹽會殘留在泵活塞和其他暴露的地方，進而縮短泵墊底壽命及導致其他部件過早損壞。比較好的辦法是事先設計一個控制程序在所有樣品檢測結束后運行洗柱程序，如前所述先用水替換緩沖液沖洗幾分鐘，然后用強溶劑沖洗系統。如果LC系統不具備這種自動轉換能力，可以設置一個低流速的方法使泵持續在極低的流速下運行，例如0.1ml/min，直到你有時間來沖洗系統。

溶解性不好的樣品

如果樣品不溶于流動相中的有機溶劑怎么辦，按照化學合成人員的溶解性測試，的確有些樣品不能完全溶解在甲醇或者乙腈中，可是對于分析測試用的樣品濃度來說，樣品不大可能不溶于相同的溶劑中。如果樣品在分析用濃度水平不能溶解的話，它怎么能在分析過程中從色譜柱上被洗脫出來呢？對于極少數情況，樣品在水-有機溶劑中的臨界濃度對其溶解性很重要。但是對于好的液相色譜系統，比較傾向樣品溶解在流動相中，并會被流動相洗脫出來。大多數色譜柱的清洗方法關注的不是樣品如何從色譜柱洗脫下來，而是如何將樣品所帶來的污染物從色譜柱上清洗掉，那么采用強溶劑將是最好的選擇。

可以采用強溶劑沖洗嗎

有些色譜工作者喜歡用一些洗脫能力比流動相中強溶劑更強的溶劑來清洗色譜柱，例如，在用乙腈沖洗色譜柱后，采用二氯甲烷或甲基叔丁基醚或者DMSO沖洗。的確這樣做可以除去一些強吸附在色譜柱的污染物，但是有時要考慮值不值得。我們從經濟角度考慮一下：對于制藥行業來說，一般一個LC-UV的分析大約要花費50美元。如果一個價值500美元的色譜柱可以持續運行500次進樣的話，那么每一次進樣花費1美元，是全部花費的2%。如果你用1h來清洗色譜柱，并使其壽命延長一倍的話，你也只是節約全部費用的1%，這是一種很好的投資嗎？我覺得如果一根色譜柱可以進樣500次的話，就已經很值了。根據經驗，即使是血樣樣品，色譜柱常常能經受2000次進樣或者更多。色譜柱是消耗品，不是固定資產，即使它非常貴也仍然是耗材。

色譜柱的再次使用

如果分析結束后總有一個用流動相中強溶劑沖洗色譜柱的程序，并且色譜柱保存在該溶劑中，那么下次再使用時就比較簡單。色譜柱用強溶劑沖洗過，所以一些強保留的污染物已經被沖洗掉了。下一次使用時，可以直接換到流動相平衡即可，通常使用10~20倍柱體積的流動相足夠了。如果不確定需要多長時間才能平衡色譜柱，只要用對照品連續2次進樣，如果連續兩次運行保留時間不變，色譜柱就平衡好了。

廠商的忠告

沒有“如果上述操作都無濟于事，請參照使用指南”這樣的忠告，任何關于色譜柱沖洗的討論都是不完全的。每一根色譜柱出廠時都配有一份使用及維護說明，如果你沒有看到它，在廠家的網址中也可以找到，色譜柱使用及維護說明一般包括建議使用的條件、pH值限度、禁用的溶劑以及清洗程序。前面所述的色譜柱清洗程序適用于幾乎所有硅膠鍵合的反相液相柱。手性色譜柱采用polymeric beads 替代硅膠作為固定相基質的色譜柱。一些正相色譜柱，以及其他特殊色譜柱，就使用的溶劑或建議使用的清洗程序來說，都會有一些限制。對于這些情況，請遵從廠商的使用說明。

結論

如果把流動相沖洗色譜柱并將色譜柱用流動相中100%的強溶劑保存這一清洗過程標準化的話，可以采用上述清洗程序來對新的色譜柱進行“磨合”；色譜柱使用后強保留污染物的清洗；或者處理要保存起來的色譜柱。若所有色譜柱均保存在甲醇、乙腈或四氫呋喃中，需要分析很多樣品時，必須要做的是用20~30倍柱體積的流動相平衡色譜柱，以1~2ml/min的流速平衡15~20min即可。連續兩次重復進樣對照品溶液，如果保留時間和峰面積相同，那么色譜系統就可以進行樣品測試了。