方法
誘餌-LexA 融合蛋白的構建
1.將編碼誘餌蛋白的靶 DNA 克隆到 LexA 融合載體（如，pMW101 或 pMW103) 的多聚接頭處，以合成一種框架內的 LexA 融合基因。確定誘餌序列的羧基端存在翻譯終止序列。形成的質粒作為 pBait。
2. 采用下列 LexA 融合基因和報道質粒的組合，建立一系列 EGY48 lexAop-LEU2 選擇的轉化酵母菌：
a.pBait+pMW112(活化測定）
b.pSH17-4+pMW112(活化的陽性對照）
c.pRFHMl+PMW112(活化的陰性對照）
d.pBait+pJK101(抑制/DNA 結合測定）
e.pRFHMl+pJK101(抑制的陽性對照）
f.pJK101單獨（抑制的陰性對照）
每種質粒功能的描述，請見表 18-1 和 18-2。
3. 將每種轉化混合物鋪在適宜的選擇性缺陷板上:CM(Glu)-Ura-His(針對質粒組合 a~e) 或 CM(Glu)-Ura(針對質粒組合 f)。將培養板在 37°C 培養 2~3d 以選擇含有質粒的轉化酵母克隆。
如果克隆在 3~4d 內沒有出現，或只有很少量的克隆（<20), 則應重新轉化。
4. 制備轉化子的母板，從中可按步驟 5~9 描述的那樣，對具有 lacZ 和 LEU2 報道子活化表型的特異性克隆進行分析。
活化和抑制活性的鑒定：X-gal 和 Leu2 表型的分析
步驟 5~9 用于測試誘餌-LexA 融合蛋白質的轉錄激活性，并證實誘餌的融合物不影響 DNA 結合活性（抑制分析的圖示請見圖 18-9)。對步驟 2 中轉化的每種質粒組合，挑選幾種單個克隆做分析。這對于某些誘餌的構建非常重要，因為蛋白質表達水平在不同克隆中會有變化，正如活化兩種報道子轉錄激活的表觀能力有變化一祥。在第一階段結束處的替代方案中，給出了一種替代步驟 5~8 的、通過氯仿交疊分析來測試活化的方法。
5. 從 a~f 的每個轉化（取自步驟 2) 中，用無菌的平頭牙簽挑選約 8 個克隆。用干凈的牙簽觸及克隆以挑取細胞，使它們在新鮮的 CM(Glu)-Ura-His 或 CM(Glu)-Ura 板上的小格內成為 lcm 長的線。通常可在一個板上形成多達 60~80 條線。將平板在 30°C 孵育過夜。
6.第二天，從兩個母板中再劃線到下列每個板上：
轉化 a~f: 劃線到 CM(Glu,X-gal)-Ura 和 CM(Gal，X-gal)-Ura 上
轉化 a~c: 劃線到 CM(Glu)-Ura-His-Leu 和 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上
7. 在 30°C 將平板孵育到 4d。
8. 對抑制和激活性進行分析；
a. 對于抑制活性，在劃線接菌約 12~24 h 時觀察 X-gal 表型。
b. 對于激活性，在劃線接菌 18 h 到 72 h 之間觀察 X-gal 表型。
c. 在 48 h 到 96 h 之間觀察 Leu2 表型。在表 18-7 中給出了具有良好表現的誘餌所應得的預期結果，并總結如下。
（1）最好在接種到 CM(Gal,X-gal)-Ural2~24 h, 應當能看出 d+e 轉化比 f 的顏色淺。
在接種到 CM(Glu，X-gal)-Ura 48 h,b 轉化應當是亮藍色,c 應當是白色，而 a 應當是白或很淡的藍色。
（2）在接種后 48 h, 在 CM(Glu)-Ura-His-Leu 或 CM(Gal)-Ura-His-Leu 上，b 轉化應當同在 CM(Glu)-Ura-His 母板上一樣很好生長，而 a 和 c 應當不生長。
（3）最理想的是,a 轉化在接種后 96 h 內仍沒有明顯的生長。
9.基于抑制和激活分析的結果，選擇適當的候選克隆。
檢測誘餌蛋白質表達
10. 在母板上，標記要分析蛋白質表達的克隆。用已證實適宜表達誘餌的克隆作為基礎菌培養，供文庫轉化用（在第二階段中）。
11. 對每個新的誘餌構建，至少分析兩個初級轉化子。還要包括兩個作為蛋白質表達陽性對照的轉化子（如 pRFHMI)。
a. 用無菌牙簽從 CM(Glu)-Ura-His 母板上挑取克隆，于 CM(Glu)-Ura His 液體培養基中生長。如果帶手套，牙簽可落入培養管并留在那里，不用擔心污染。
b. 在滾筒或其他搖動儀器上 30°C 培養過夜。
c. 早晨，將達飽和的培養液稀釋到含 3~5 ml CM(Glu)-Ura-His 的新培養管中，使初始密度 OD600 約為 0.15。30°C 培養 4~6 h, 直到光密度大約增大兩倍（OD600 約 0.45~0.7)。
12. 轉移 1.5 ml 培養液到一個微量離心管中，在離心機上以最大速度離心細胞 3~5 min。可見沉淀的體積應為 2~5ul。小心傾去或吸除上清。
一些（盡管不是所有）LexA 融合蛋白隨生長靜止相啟動，表現出可檢測的蛋白質水平急劇增加。因而，不需要為了期望増加分析蛋白的產率而使培養進行到飽和。
如果預期要進行一輪以上的分析，在此階段冰凍雙份樣品可能會有好處。
13. 加入 50ul 的 2XSDS 凝膠加樣緩沖液到離心管中，快速震蕩離心管以懸浮沉淀。立即將離心管放在干冰上或干冰/乙醇浴中。
樣品或即刻用于分析，或在-70°C 冰凍，這樣至少可以保持穩定 4~6 個月。
14. 將樣品從干冰或-70°C 直接轉到 100°C, 并煮沸 5 min。
設定到 100°C 的 PCR 僅最方便，當然也可用水浴或加熱。
15. 將樣品在冰上冷卻并在離心機上以最大速度離心 5~30s 以沉淀大的細胞碎片。加 20~50ul 樣品到 SDS 聚丙烯酰胺凝膠的每個泳道中。
16. 電泳并分析產物以確定預期大小的誘餌蛋白是否以合理的水平表達。
17. 為防止可能出現的問題，通過免疫印跡來分析含 LexA 融合的誘餌的酵母裂解液（請見這一步的注解)。
免疫印跡可按附錄 8 描述的進行。LexA 融含物可用計對融合域的抗體來檢如果沒有，也可用抗 LexA 的抗體替代。
確定一種誘餌蛋白的重要一步是直接分析誘餌是否可被檢測到，以及誘餌大小是否正確。在多數情況下，上述兩項都是正確的。然而，一些蛋白質（特別是融合域在約 60~80kDa 或更大時）或者合成水平很低，或者在翻譯后被蛋白酶剪斷。這兩種結果都可能導致在文庫篩選中出現問題。低水平表達以及在轉錄活化分析中無表觀活性的蛋白質, 可在亮氨酸選擇下上調到較高水平，然后突然顯示轉錄活化的高背景。在蛋白質由于發生蛋白質水解而剪斷時, 對于僅與較大誘餌的氨基端融合的 LexA 來說，篩選仍然可以進行。
第二階段 篩選一個相互作用子
材料
緩沖液和溶液
將貯存液稀釋至適當的濃度
二甲基亞砜（DMSO)
乙醇
可選擇，請參見步驟 9。
凍存轉化體用的無菌甘油溶液
65% 無菌甘油
0.1mol/LMgS04
25 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
TE(pH7.5)（無菌）
TE(pH7.5)，含 0.1mol/L 乙酸鋰
TE(pH7.5), 含 40%PEG4000 和 0.1mol/L 乙酸鋰（無菌）
核酸和寡聚核苷酸
載體 DNA
剪切處理的鮭精 DNA 為典型的常用載體。髙質量的 DNA 是非常重要的。使用低質量的制品可能降低 1~2 個數量級的轉化頻率。生產髙質量鮭精 DNA 的簡便方法請參見 Schiestl 和 Gietz(1998) 的方法和第 6 章方案 10, 也可選擇許多公司出售的這種商品。
相互作用篩選文庫
培養基
CM 選擇培養基
利用表 18-3 估計所需培養基的量，根據表 18-8 制備所需的選擇培養
無氨基酸的酵母 (YNB) 分含或不含硫酸銨兩類，均有銷售。表 18-8 中假定 YNB 中含有硫酸銨。如果酵母氮源包裝瓶上說明制備培養基需加 1.7 g/L 酵母氮源，那么它躭不含有硫酸銨，配制時每升培養基中應加入 5 g 硫酸銨。
酵母選擇 X-gal 培養基
1. 按照表 18-8 在 900 ml 水中制備基礎培養基，高壓滅菌后冷卻至 55°C。
2. 在另一個瓶于中，將 7 g 磷酸氫二鈉和 3 g 磷酸二氫鈉溶于 100 ml 蒸餾水中，高壓滅菌。
3. 將兩種髙壓滅菌溶液混合在一起，加入 0.8 ml 濃度為 100 mg/ml 的 X-gal(格于 N,N-二甲基甲酰胺), 鋪制平板。
離心機和轉子
Sorvall GSA 轉子或等同物
Sorall RT6000 離心機和 H1000B 轉子或等同物
專用設備
選擇培養基用培養極（24 cmX24 cm)(見表 18-3)
這些培養板非常昂貴，但是可以重復使用很多次（見步驟 9)。
Falcon 管（50 ml，無菌）
玻璃珠（直徑 0.45 mm, 無菌；Sigma)
可選，請見步驟 9。
加熱塊，預設至 42°C
微量滴定板（96 孔）
可進，請參見步驟 21。
多道移液器或接種多支管/蛙形器（例如 Dankar Scientific)
可選，請參見步驟 21。
用于多菌落轉移的蛙形器可以購買或自己制造也很容易；蛙形器的所有輻條都有一個平坦的表面且輻條末端保持水平是很重要的。蛙形器可以通過高壓或乙醇灼燒來滅菌。
載體和細菌菌株或酵母菌株
攜帶表達誘餌蛋白質和 lexAop/lacZ 報道子的載體的釀酒酵母候選菌株（來自第—階段）。