實驗材料 細胞
試劑、試劑盒 辛醇PMSF
儀器、耗材 攪拌機光學顯微鏡
實驗步驟
1. 檢測所用細胞數量。
2. 收獲細胞前在冷環境中強力攪拌時，在所有溶液中加入蛋白酶抑制劑。
3. 在培養基 A 中加入辛醇，混合均勻。
在培養基 A 中加入辛醇和 PMSF，即為培養基 B。
4. 用吊桶式轉頭在 250 ml 的圓錐離心瓶中于 2℃，1500~2000 g 離心 5 分鐘收獲細胞。
5. 快速倒出上清，攪拌松動沉淀。
6. 直接在培養基 B 中重懸沉淀細胞。
細胞破碎
7. 在冷的攪拌機中高速攪切 30~60 秒破碎細胞。
8. 用光學顯微鏡檢查勻漿物，載玻片上放少量勻漿物，加上甲基綠。保證小核已從其臨近大核的“杯狀”處被移去。
差異核片狀沉淀
9. 將攪拌過的細胞倒入圓錐形離心瓶中，用吊桶式轉頭在 0~4℃ 于 1500~2000 g 離心 5 分鐘。可用 50~250 ml 的離心瓶。
10. 輕微搖動瓶，使上清表面形成的表層松動，將上清和表層倒入冷的攪切機中。
11. 用少量細胞核洗滌緩沖液重懸片狀沉淀，用甲基綠染色后在光學顯微鏡下仔細觀察小量、檢測大核和小核的數量。
12. 將片狀沉淀收集到試管中，標記為 Pn。
13. 高速攪切上清 20 秒，用較高速度離心 5 分鐘。
14. 收集上清，在細胞核洗滌緩沖液中重懸片狀沉淀，按照步驟 11 檢測細胞核。
15. 重復攪切和離心，提高離心速度，分析每次的片狀沉淀，直到沉淀中幾乎沒有大核為止。
16. 當最后觀察的片狀沉淀中小核為大多數時，高速攪切上清 20 秒，用吊桶式轉頭在 0~4℃ 于 5000 g 離心 5 分鐘。
17. 收集上清，將片狀沉淀懸于細胞核洗滌緩沖液中，按照步驟 11 檢測片狀沉淀。
計數分離的細胞核總數
18. 集中適當的含有大核的片狀沉淀；小核也同樣。用細胞核洗滌緩沖液重懸核于適當的體積內。
19. 用甲基綠稀釋少量的大核或小核。用分光光度計計數細胞核數量，計算基于起始細胞的數目。假定生長或饑餓過程中每個細胞有一個大核和一個小核；接合過程中每個細胞的細胞核數量依賴于所處階段有很大變化。
20. 當大核和/或小核收量合適，可在 0~4℃ 于 2000 g 離心 5 分鐘收獲細胞核。
21. 在少量細胞核洗滌緩沖液中重懸細胞核，用小離心管離心 5 分鐘洗滌細胞核。
