外源基因在真核細胞表達技術

生化方法

l      磷酸鈣介導的質粒DNA轉染真核細胞

1.      轉染前24 h，通過胰酶消化收集細胞，用適當的完全培養基以1×10⁵至4×10⁵細胞/cm²的密度平鋪細胞于60 mm組織培養皿或12孔板上。于含5%～7% CO₂的37℃溫箱孵育20～24 h。轉染前1 h換液。

2.      按照下屬方法制備磷酸鈣-DNA沉淀：于5 ml滅菌塑料管內混合100μl 2.5 mol/L CaCl₂與25μg質粒DNA，如有必要用0.1×TE（pH7.6）將體積補至1 ml。室溫下將以上2×鈣-DNA溶液與等體積的2×HEPES鹽溶液混合。迅速彈敲試管側壁混勻溶液，靜置1 min。

3.      立即將磷酸鈣-DNA懸液轉移至上述單層細胞的細胞培養基中。每1 ml培養基加0.1 ml懸液。輕輕搖動平皿混勻培養基，培養基會變成混濁的橘黃色。一旦形成DNA沉淀，轉染效率會大大降低，因此此步動作應盡可能迅速。如果是用氯喹、甘油與/或丁酸鈉處理細胞，直接進行步驟5。

4.      如果轉染的細胞不用轉染促進劑處理，則置于含5%~7%CO₂的37℃溫箱孵育。2～6 h后，吸去培養基與DNA沉淀。加入5 ml 37℃預熱的完全培養基，將細胞放回孵箱孵育1～6天。繼續步驟6檢測轉染DNA的瞬時表達，或者如果是穩定轉化則直接進行步驟7。

5.      在磷酸鈣-DNA沉淀物的存在下用氯喹處理細胞或者吸去沉淀溶液后將細胞暴露于甘油與丁酸鈉中會促進細胞吸收DNA。

用氯喹處理細胞

氯喹是一種弱堿，推測是通過抑制細胞內溶酶體水解酶降解DNA而發揮作用（Luthman and Magnusson 1983）。細胞對氯喹毒性的敏感度限制了培養基中加入氯喹的濃度及時間，不同細胞所需氯喹最佳濃度根據經驗而定。

a.       在把磷酸鈣-DNA沉淀物加入細胞前或后按1：1000將100 mmol/L氯喹直接加入培養基中。

b.      細胞于含5%~7%CO₂的37℃溫箱中孵育3～5 h。

c.       在用DNA于氯喹孵育細胞后，移去培養基，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，加5 ml預熱的完全培養基。細胞于孵箱中培養1～6天。繼續步驟6檢測轉染DNA的瞬時表達，或者直接進行步驟7以獲得穩定轉化子。

丁酸鈉處理細胞

丁酸鈉的作用機制并不確定；但它是組蛋白乙酰化形成使外來質粒DNA趨于轉錄的染色質結構（Workman and Kingston 1998）。

a.       甘油休克處理后，將500 mmol/L丁酸鈉直接加入生長培養基（甘油處理的步驟d）。細胞類型不同，所用丁酸鈉的濃度也不同。例如：

CV-1           10 mmol/L

NIH-3T3         7 mmol/L

HeLa            5 mmol/L

CHO            2 mmol/L

其他細胞系所需濃度依經驗而定。

b.      細胞于孵箱中培養1~6天。繼續步驟6檢測轉染DNA的瞬時表達，或者直接進行步驟7以獲得穩定轉化子。

6.      若要檢測細胞轉染后導入DNA的瞬時表達，可在轉染后1~6天收獲細胞。雜交分析DNA或RNA。通過體內代謝標記進行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測定細胞提取物的酶活性來分析新合成蛋白。

7.      分離穩定轉染體

a.       用非選擇性培養基孵育細胞24~48 h，使轉染的DNA有足夠時間表達。

b.      胰酶消化細胞并重鋪細胞于選擇性培養基中，或者直接加選擇性培養基/

c.       每2~4天更換培養基，持續培養2~3周，目的是清除死細胞殘骸，促進抗性細胞生長。

d.      克隆獨立菌路、繁殖，以用于檢測（方法見Jakoby and Pastan 1979或Spector et al. 1998b [《細胞試驗手冊》的第86章]）。

e.       用預冷的甲醇固定細胞15 min，然后室溫下用10% Giemsa染色15 min，流水沖洗，這樣可以記錄細胞克隆數目。

物理方法

l      電穿孔轉染DNA

1.      細胞生長到對數中期或晚期時收集細胞，用包有橡皮的玻璃棒或胰酶釋放貼壁細胞。4℃、500g離心5 min（Sorvall H1000B轉子用1 500r/min）.

2.      用0.5體積的初始培養基重懸細胞，用血細胞計數器計細胞數目。

3.      離心（同步驟1）收集細胞，室溫下用培養基或磷酸鹽緩沖液重懸細胞至2.5×10⁶~2.5×10⁷細胞/ml。

4.      將400μl的各等份細胞懸液（10⁶～10⁷細胞）加入標記好的電轉化池中，冰浴。

5.      設置電轉化參數。一般電容量為1050μF。電壓在200 V和250 V之間，不同細胞系所需電壓不同，平均為260 V。內部阻抗設為無窮大。進行電穿孔前先用一個裝有PBS的電轉化池放電至少兩次。

6.      每一裝有細胞的電轉化池內加入10～30μg、體積最大可至40μl的質粒DNA。用吸管將DNA與細胞輕輕混勻。立刻繼續進行第7步。

7.      立即將電轉化池移至電極間放電，1～２min后，取出電轉化池，水浴，立即進行下一步操作。

8.      用帶有高壓滅菌吸頭的微量移液器將電穿孔的細胞轉移至35 mm培養皿中。用等體積的培養基洗滌電轉化池，洗液加入培養皿。培養皿置于含5%～7% CO₂的37℃孵箱。

9.      重復第6～8步，電轉化所有DNA與細胞樣品。記錄下每一電轉化池的實際脈沖時間以便于比較。

10.  如要獲得穩定轉化體，直接進行第11步。如果是瞬時表達，則于電穿孔24～96 h后用下述方法之一檢測細胞：

l        如果使用的是表達E.coli β-半乳糖苷酶的質粒DNA，檢測細胞裂解液中酶活性。

l        如果使用綠色熒光蛋白表達載體，在450~490 nm光照下用顯微鏡檢測細胞。

l        如果使用其它基因產物，則通過體內代謝標志物進行放射免疫、免疫印漬、免疫沉淀或測定細胞提取物的酶活性來分析新合成蛋白。

11．分離穩定轉染體：用完全培養基培養48~72 h后，胰酶消化細胞，用適當的選擇性培養基重鋪細胞。每2~4天換液一次，持續2~3周，目的是去除死細胞殘骸，并允許抗性細胞克隆生長。此后，克隆、繁殖獨立克隆以用于檢測[方法見Jakoby and Pastan 1979 或Spector et al. 1998b (《細胞試驗手冊》的第86章)]。