四、血細胞形態學采樣、制片染色與檢查要求：
(一) 采樣、制片及染色，三道工序至關重要：是細胞形態學檢查的成敗關鍵。要得到合格的涂片標本，做好上述工序，應注意以下要求：
采樣、制片：
●玻片要求：國內1.0mm×26mm×76mm±0.5，美國NCCLS規定1.0mm×25mm×75mm±0.5，要嚴格清潔，接近中性.
●推片：選擇優質推片，推片兩端邊緣整齊、平滑。也可選用有機玻璃，其大小、厚度與坡片相同，兩端之邊緣應加工光滑，以利推片用。
●采外周血（樣），擦去第一滴血，迅速采血，量適中，如綠豆粒大小，具有一定推片技術，推片傾斜45°±，推成血膜長度25mm～35mm，寬度18～20mm，血膜四周留有空隙區，血膜終尾離玻片終端至少10mm，血膜均勻，薄如蟬翼，尾端形如弧狀，迅速扇（搖）干，血膜具有頭、體、尾不同厚薄區域。此外，涂片時，還要考慮患者的血液狀態，如貧血程度、血液粘稠度、WBC或有核細胞多少等因素，調整推片技巧。
2．涂片染色：是識別細胞形態的重要標記工序：
（1）常規瑞氏-姬姆薩染色要點：
●要得到滿意、漂亮的血細胞涂片染色標本，新鮮涂片迅速染色是很重要的。
●染色液配制要合格；
●涂片切勿用甲醛固定，否則不著色；
●染色的好壞與染色液、緩沖液的質量及比例、加液間隔時間、保持玻片染色液面的張力等染色技巧均有重大關系。染液要覆蓋涂膜面，再加緩沖液（1:2），其量要充足、混均，染色時間要30分鐘以上。
（2）細胞著色的觀察：
●當染液與緩沖液混合后，甲醛吸水液溫升高，發生劇烈反應，直至液膜表面的“染色粒”呈均勻分布，隨染色時間的推延，“染色粒”由“染色小粒”聚集成“染色大粒”，逐漸由外緣向內緣推進至染色面中心（此過程需要20-30分鐘以上），則表明細胞著色已完成，
●再用自來水緩流沖洗，使染色液沉渣及染色粒浮去，使其充分起分色作用，去除細胞染色中浮色，顯示出胞核結構及細胞清晰形態，待干，鏡檢。
五．外周血細胞形態學檢驗技巧
（一）WBC形態學
（二）紅細胞形態學
（三）出現有核（內/巨幼）紅/幼粒細胞意義
（四）血小板巨核細胞
外周血中三種血細胞數與形態學表現：
○反映骨髓造血狀態及血液病和其他疾病的廚窗；
○是檢查與觀察疾病的重要指標；
（一） WBC形態學診斷技巧：
1．WBC數值準確性估計：
（1）目前自動化計數儀時有出現結果的偏差，低倍鏡觀察血涂片可以粗略估計WBC數值及分布。低倍視野WBC數：正常約3～ 5個，增多6個以上，減低3個以下。
（2）WBC如推至片尾，分布不均，估計將有一定難度。較大的細胞如單核、異淋及中性粒細胞及不成熟細胞多在片尾，體部則多為較小的淋巴細胞，使分類造成偏差，所以分類部位在適當調整。
2． 白細胞計數值限度分級：
（1）WBC正常范圍：4.0~10.0×109/L;
（2）WBC正常限度以下:
輕度減少(<4.0～3.0×109/L),
中度減少(<3.0～2.0×109/L),
極度減少(<2.0×109/L);
（3）WBC正常高限度以上:
分輕度增多(>10.0～20.0×109/L),
中度增多(>20.0～40.0×109/L),
明顯增多(>40.0～80.0×109/L)
極度增多(>80.0×109/L)。
以此與所測知WBC計數值作粗略對比，推斷WBC計數值的準確性。
（4）如在血片分類計數過程中發現較多有核紅細胞時，
●計出血片中有核紅所占%率，即以校正原WBC計數值減去有核紅所占比例，求出外周血中WBC總數值，
● 另作WBC分類計100個過程中遇到多少有核紅細胞，即有核紅細胞 個/100個WBC，
●或作血片有核細胞分類計數（包括有核紅細胞），計出有核紅細胞所占%率。
3． WBC分類正常范圍及其病理性改變：
（1）WBC分類正常范圍：
新生兒出生后最初24小時白細胞數高，主要為中性粒細胞,至第3～4周，中性粒細胞與淋巴細胞比例倒轉，直至4歲淋巴細胞比例仍多。見表一
表1 正常成人白細胞分類范圍：
% 有 絕對值/ 109 L
中性粒細胞 40 ～ 75 2.8～7.5×109
淋巴細胞 20 ～ 50 1.5～3.5×109
單核細胞 2 ～ 10 0.2～0.8×109
嗜酸性粒細胞 1 ～ 6 0.04～0.4×109
嗜堿性粒細胞 <1 0.015～0.1×109
白細胞分類正常范圍由于民族、地區、年齡、性別及其生理性變化的影響，以及檢查本身的技術差異，即使一人同次取材不同涂片、一張涂片多次分類計數結果也不可能完全一致，但不可差異太大。見表二
表2 NCCLS對分類中的一些術語含量作了規定
術 語 %（相對值） 絕對值（109/L）
WBC增多：總數 - > 1 2.0
中性粒細胞增多(相對) > 7 5 > 9.0
嗜酸性粒細胞增多 > 7 > 0.5
嗜堿性粒細胞增多 > 2 > 0.15
單核細胞增多 > 10 > 0.85
淋巴細胞增多 > 47 > 3.2
WBC減少 - < 4.0
粒細胞減少 < 40 < 1.75
分類中占大比例的中性粒細胞或淋巴細胞呈正態分布，占小比例的嗜酸/嗜堿性粒細胞及單核細胞則為Poisson分布。
（2） 病理性形態學改變：
中性粒細胞
●中性粒細胞分葉分化程度，
○被認為從干細胞至粒細胞生成是否正常及與粒細胞年齡相關；如核分葉不良，Pelger-huet現象；
○核僅一葉或二葉，其百分率增加時謂之“左移”，反之，多數細胞四葉以上謂之右移，
○一般認為正常中性粒細胞胞核分葉情況：
--4葉者為 15～25% 3葉者為 40～50%
--2葉者為 20～40% 1葉者為 < 5%
-->5葉以上者提示有巨幼細胞性貧血的可能。
○右移現象：-多見于巨幼細胞性貧血、肝臟疾患，并可以5葉與4葉所占比例計算，得出簡單實用的分葉指數：
分葉指數 =5葉/4葉 × 100% 正常核分葉指數：0～17%
-還見于缺鐵性貧血、類風濕性關節炎、遺傳性高分葉癥（顯性遺傳）及某些敗血癥（以左移多見）。
○左移現象-見于感染、敗血癥、出血、小兒慢性中性粒細胞減少癥等。
●中性粒細胞毒性顆粒及空泡改變：中性粒細胞由于受到外來刺激（包括感染及應激反應）引起顆粒變性，粗大著色深染及漿內空泡等病理性改變。上述改變及白細胞數增多和出現幼稚及原始細胞則為類白血病反應。
○慢性粒細胞白血病（CGL）的中性成熟粒細胞一般胞漿顆粒較正常稀少，但無空泡及毒性顆粒，而慢性中性粒細胞白血病（CNL）的中性成熟粒細胞則與類白血病反應形態相似。
○假性嗜酸性顆粒形態異常：類似嗜酸性樣顆粒的出現。-在某些干細胞疾病如MDS、粒細胞缺乏癥、腎性貧血某些患者中性粒細胞的顆粒增多
○遺傳性白細胞異常疾病：是先天性白細胞異常疾病，臨床上雖罕見，但為了提高辨別的能力，應有所認識。
○
Pelger-Huer白細胞異常：屬于顯性遺傳，其白細胞形態特點：核分
葉不良，不分葉，核呈花生形、亞鈴形等形狀，無核絲形成，胞漿正常，此外，還有假性（即繼發性）Pelger-huet白細胞異常應加以鑒別，后者常見于急性腸炎、傷寒、瘧疾、流感，無家族史，但在原發病得到治療后白細胞形態恢復正常。
○ Alder-Reilly顆粒異常：常染色體隱性遺傳性多糖代謝障礙性疾病，常伴有軟骨畸形、肝、脾腫大等，中性、嗜酸性及嗜堿性粒細胞含有多量嗜天青顆粒遮蓋整個細胞，單核細胞亦有類似改變。
○ May-Hegglin異常：為常染色體顯性遺傳疾病，在中性及嗜酸性粒細胞漿內含有Dunle小體，常伴有巨血小板及血小板減少、紫癜，由于細胞的游走功能差，故病人常出現感染癥狀。繼發性也可見于猩紅熱、球菌性感染、燒傷早期等某些病例。
●嗜酸性粒細胞：此種細胞在人體每日規律性變動，晨至午下降，午后始升，午夜至次晨3時達高峰數值，哮喘患者及夜間工作者其規律與正常相反，晨9至12時達高峰。
○臨床上嗜酸性粒細胞增多見：
○過敏性疾病:如血管神經性水腫、哮喘、食物及藥物過敏、血清 病、蕁麻疹、枯燥熱等。
○寄生蟲病：常見于血絲蟲、鉤蟲、包囊蟲、肺吸蟲、蛔蟲、呂弗氏（Lofllers）綜合征、蟯蟲、旋毛蟲、瘧疾（偶見）及血吸蟲等。
○皮膚病：如濕疹、剝脫性皮炎、天皰瘡、牛皮癬、瘧疾、疥、感染、猩紅熱早期等。
○血液病：高嗜酸性粒細胞綜合癥、CML、嗜酸性粒細胞白血病、何杰金氏病（占10%病例）、嗜酸性肉芽腫、家族性嗜酸性細胞增多癥、熱帶嗜酸性細胞增多癥、甲狀腺癌及播散性結締組織病。
○與化學藥物有關：鎳（致皮膚炎）、青霉素、PAS、苯、呋喃妥因、磺胺等。
●嗜堿性粒細胞：
○在正常人血液中為數甚少，該細胞嗜堿性顆粒含大量組織胺及肝素類物質，
○臨床上主要因骨髓增殖性疾病常伴嗜堿性粒細胞增多如CGL、CGL嗜堿變、嗜堿性粒細胞白血病、M4EO、真性紅細胞增多癥、骨髓纖維化、何杰金淋巴瘤、、溶血性貧血、腫瘤等，
○還可見于感染恢復期、甲狀腺功能低下肝硬化、結核病、流感、以及月經初潮等.
●淋巴細胞：
○淋巴細胞為免疫反應細胞，來源于骨髓淋巴干細胞，經胸腺素作用分化為T淋巴細胞，參與細胞免疫，另一類經骨髓而成為B淋巴細胞，產生免疫球蛋白，可作為體液免疫。
○外周血內淋巴細胞可分為大、中、小淋巴細胞，其形態一般不難辯認。
○在臨床由于各種因素刺激出現異常淋巴細胞，常出現于病毒感染性疾病，如傳染性單核細胞增多癥、傳染性淋巴細胞增多癥，傳染性肝炎、水痘、風疹、流感、結核病、藥物過敏、慢性感染、放射病、應激狀態及免疫異常等。
○異常淋巴細胞其胞體增大，比正常淋巴大一倍以上，核染色質疏松、增多，胞漿豐富或不規則、有很強嗜堿性呈深蘭色、不均勻不透明或有泡沫或深蘭色、周邊著色加深，可見嗜天青紅顆粒或空泡。
按Doney氏類型分三型：
Ⅰ型：最多見，胞體增大，核圓、卵圓或腎形，染色質疏松、粗糙，胞漿豐富、深染,有泡沫或空泡，偶有嗜天青顆粒，核/漿約1:1。
Ⅱ型：胞體較大，主要胞漿明顯增多，且不規整（體如單核細胞），染色質較致密，不如Ⅰ型增多聚集，胞漿淡蘭染，少數有嗜天青顆粒或少許空泡，核/漿為1:2。
Ⅲ型：少見，大致與Ⅰ型相似。可有核仁。
●此外,Tuck細胞即刺激細胞也是一種異常淋巴細胞,其意義與上述異常淋巴細胞相同。
●外周血中惡性淋巴細胞見于下列疾病：原幼淋巴細胞-見于ALL或CLL淋巴瘤。多發性骨髓瘤、淋-漿細胞-華氏巨球蛋白血癥、毛細胞-毛細胞白血病。
●幼淋細胞（Prolympho Cytic Cell；PLC）屬于幼淋細胞白血病（Prolymph Cytic Lenkemia；PLL）的病理性細胞，介于幼淋與成熟淋巴細胞之間的特殊幼淋細胞，具有成熟的核染色質與核仁并存的發育失衡的異相為最突出的特征。
●單核細胞：
是血中吞噬性細胞，參與免疫作用，在新生兒出生后一周內，在外周血中單核細胞可高至4.0×109/L ，平時由于采血部位及時間不同也有差異。臨床上，單核細胞增多見于以下情況：
○常見于細菌感染、結核、細菌性心內膜炎、布氏桿菌病、菌痢或感染性疾病恢復期。
○寄生蟲病：瘧疾、錐蟲病、黑熱病、阿米巴肝膿腫等。
○惡性疾病：慢性單核細胞白血病、慢性粒-單核細胞白血病（CMML）、MDS及惡性腫瘤。
（二）紅細胞形態學診斷技巧：
1．RBC/Hb、網織RBC、MCV、MCH、MCHC及RBC體積分布寬度（RDW）是判定貧血類型重要依據：
(1)Hb/RBC比值：正常人：Hb/RBC比值為3gHb/L=100萬RBC/ μL即3:1。AA、溶血性貧血及繼發性貧血等屬此類。>3:1者即為大細胞高色素性貧血,<3:1者為小細胞低色素性貧血.
(2)網織RBC是新生的RBC，可反映造血機能的好壞：正常情況下為0.5~1.0%,代償性反應者多>5%。其網織RBC內嗜堿性網織增多，代償性功能減低者，低于正常水平。多見于AA，但有不典型AA（1/4）患者可有網織RBC增高。網織RBC計數1000個RBC中有多少網織RBC，以其%數表示，是一個比值數，不是絕對值。精確應計算絕對值或用流式細胞儀計數更為確切。
(3)MCV、MCH、MCHC反映RBC病理變化：可將貧血分為大細胞性貧血、正常細胞性貧血、小細胞低色素性貧血及單純小細胞性貧血（即小細胞性正常色素性貧血），其診斷標準及其病因。
2．RBC形態學在檢驗中常被忽視，
(1)觀察RBC形態一般以外周血涂片較為可靠。
(2)RBC形態與排列（如重疊、緡錢狀）與涂片技術、涂片部位及厚薄有很大關系。這點在鏡檢時應予注意。
(3)即是合格涂片，RBC形態依然與涂片部位及厚薄等多種因素有關：
○如取涂片中心區域，RBC中心淡染，多 >1/3細胞面積大小;
○取自涂片薄處或尾部，RBC形態誤給人以“球形”，失去雙凹盤形，中心淡染消失，所謂類球形改變；
○取厚片或制片干燥過慢，RBC未攤開，收縮變形，甚至出現人工中心染色過淡等；
○取厚片RBC則重疊堆積，呈假“緡錢狀”，不便查清形態；
○玻片不清潔，油脂過多或骨髓脂肪過多，制片干燥不快，RBC則會形成人工的中心淡染區或空白區。
