小分子熒光抑制劑實現酶高分辨成像的新方法

大連化物所復雜分子體系反應動力學研究組（1101組）韓克利研究員團隊基于氨基甲酸酯母核的結構與功能關系，設計并發展了小分子抑制劑型熒光探針（SMI-probe），在重要的藥物代謝酶羧酸酯酶（Carboxylesterases，CEs）的實時熒光高分辨檢測中取得了良好的應用效果。由于抑制劑型探針分子NIC-4的分子結構簡單，體積小，且具有針對CEs的超分辨響應靈敏度，因此在細胞原位檢測中能夠獲得更加真實的成像效果，為亞細胞器層面的酶標記提供了新的設計思路與成功范例。

　　羧酸酯酶CEs是一類重要的水解酶，在外源性藥物代謝過程中，其負責催化的酯水解過程，是包括伊立替康等在內的抗癌藥物起效的關鍵激活步驟。此外，CEs在維持內源性脂質和糖代謝穩定中發揮著十分重要的作用。對CEs的原位實時熒光標記，是實現糖/脂代謝平衡深入理論研究及抗腫瘤藥物應用效果監測的實踐基礎。傳統的免疫熒光標記策略能夠標記CE，但該方法操作復雜，依靠免疫級聯反應實現的信號放大對所應用的抗體質量有非常高的要求，標記抗體結構過大會導致成像失真，且只能用于固定細胞，無法實現實時在體成像。

　　利用熒光核偶聯識別基團是超分辨探針設計的一大策略，目前已有納米顆粒（Nanobodies），適體（Aptamers）熒光標記等策略。基于輕便且具有高選擇性標記的超分辨熒光探針的應用需求，韓克利團隊在被標記蛋白配體屬性的結構功能研究的基礎上，結合數據分析與挖掘，發現氨基甲酸酯類化合物在羧酸酯酶催化識別上具有顯著的分型特點，即具有R₁-NH-CO-R₂型結構特點的氨基甲酸酯類化合物趨向于成為可被羧酸酯酶催化代謝的底物，而R₁-NR₂-CO-R₃型則易成為羧酸酯酶的抑制劑化合物。基于此，團隊選擇結構較小的熒光基團萘酰亞胺，將抑制劑結構基礎與熒光母核進行直接連接，設計得到小分子抑制劑型熒光探針NIC-4，通過理論計算確認，其抑制性質來源于酰胺鍵中較大空間位阻的取代基對酶活性中心絲氨酸親核進攻過程的阻礙。進一步通過抑制屬性檢測、熒光屬性標定、標記選擇性驗證等，團隊確認了探針小分子的優良體外屬性，并在細胞層面對亞細胞器的實時熒光標記表現進行了驗證，結果顯示，設計得到的超分辨熒光探針小分子不僅在標記選擇性上優于免疫熒光方法，也具有良好的細胞耐受性（低細胞毒）、高檢測靈敏度、熒光穩定性等，應用其進行長時間的細胞動態效應觀測，具有顯著優勢。

　　相關成果以“Directional Modified Fluorophores for Super Resolution Imaging of Target Enzymes: A Case study with Carboxylesterases”為題，發表在《藥物化學》（Journal of Medicinal Chemistry）雜志上。該工作的第一作者是我所1101組賈燕助理研究員和北京大學深圳醫院博士后王家悅。該工作得到國家自然科學基金、博士后面上基金等項目的資助。（文/圖 王家悅、賈燕）

　　文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.1c01469