血液分析儀綜述(一)

第一節 概述
血液分析儀（Hematology Analyzer），又稱血細胞分析儀（Blood Cell Analyzer），也可稱為血細胞計數儀（Blood Cell Counter）,主要用于檢測血液標本，能對血液中有形成分進行定性、定量分析，并提供相關信息的儀器。

一、產品定義、性能及應用特點
自50 年代初庫爾特先生發明了粒子計數技術的ZL,制造了第一臺血液分析儀并應用于臨床以來,血液分析儀的發展已有60年的歷史。血液分析儀實質上是指對一定體積內血細胞數量及異質性進行分析的儀器。最初的血球計數儀(Cell Counter)僅能計數紅細胞(RED)和白細胞(WBC),后來又有了血紅蛋白HBG),血小板(PLT),紅細胞壓積(HCT),平均紅細胞體積(MCV)等幾個參數。而發展成為血液分析儀 (Hematology Analyzer)后,又增加了許多分析和計算參數,如紅細胞體積分布寬度(RDW),平均血小板體積(MPV),血小板體積分布寬度(PDW),血小板壓積(PCT),大血小板比率,白細胞三分群,白細胞五分類,血紅蛋白濃度分布寬度,異常淋巴細胞提示,幼稚細胞提示等各種參數和功能也不斷地添加到一些品牌的儀器上。

為了紀念庫爾特先生對血液分析儀的貢獻，特將其計數原理命名為庫爾特原理（the coulter principle）即電阻抗原理，該原理現已成為血細胞計數和分析中最經典的原理。庫爾特原理的基本含義是:在待測液體中置一微孔,在微孔的兩端各加一定電壓的電極,當液體中的顆粒經過微孔時,電極間的電阻就會產生瞬間的變化,以因而產生電脈沖,對這種電脈沖進行計數就可得到顆粒的數量,脈沖幅度的大小表示顆粒的體積的大小,經過對各種細胞所產生脈沖的大小的電子的選者擇,可以區分出不同種類的細胞;在液體中加上一定的負壓就能使經過微孔的液體流動。

隨著電子技術,流式細胞技術,激光技術,電子計算機技術和新熒光化學物質等多種高科技技術在臨床檢驗工作的應用,使血液分析儀在自動化程度,先進功能和完美設計方面提高到了一個嶄新的階段,血液分析儀已經不僅僅局限在進行常規的血細胞分析,還增加了許多擴展功能,例如將網織紅細胞(RET)的計數和分析功能加入其中,一些儀器還另外增加了幼稚細胞分析和有核紅細胞分析功能,甚至對血液細胞中某些寄生蟲進行提示,更有一些儀器把流式細胞分析儀的某些功能合并到血液分析儀上,在進行常規血細胞分析時可得到某些淋巴細胞亞群的分析結果。

在常規血細胞計數儀上,紅細胞(RBC),血小板(PLT)共用一個測量通道,血紅蛋白含量(HGB)的測定在任何類型,檔次的儀器中其測試原理都是相同的。白細胞的計數和分類有其專用的通道,現就對分析儀上各測試項目所使用的技術方法和原理作些簡要介紹。

1、血紅蛋白含量測定
血紅蛋白含量的測定是在被稀釋的血液中加入溶血劑后,使紅細胞釋放出血紅蛋白,后者與溶血劑結合形成血紅蛋白衍生物,進入血紅蛋白測試系統,在特定波長(一般在530-550nm)下比色,吸光度的變化與液體中Hb 含量成比例,儀器便可顯示Hb 濃度。不同系列的血液分析儀配套溶血劑配方不同,形成的血紅蛋白衍生物也不同,但大多數的最大吸收光譜接近540nm。近年來許多高檔的分析儀上采用了激光散射法進行單個血紅細胞血紅蛋白的分析,以盡量減少高WBC,乳糜血,高膽紅素等對HBG 比色的影響。

2、血紅細胞及血小板的檢測
血紅細胞的檢測是血液分析儀的重要組成部分,紅細胞的檢測以往主要還是使用阻抗法對紅細胞的數目和體積計數,以此分選出不同大小的信號并打印出紅細胞體積分布直方圖。但現在也采用光學和電阻抗法結合的處理方法對紅細胞體積進行三維空間分析(3D)以期得到更正確的結果。如拜爾的ADVIA 120以光散射法檢測紅細胞,以低角度前向光散射和高角度散射兩個測量系統同時測量1 個紅細胞,根據低角度光轉換能量的大小測量單個紅細胞體積與總數;根據高角度的光散射得出單個血紅蛋白濃度,可準確得出MCV(平均紅細胞體積),MCH(平均血紅蛋白含量),MCHC(平均血紅蛋白濃度)測定值,并繪出紅細胞散射圖,單個紅細胞體積及紅細胞內Hb 含量的直方圖及求出RWD(紅細胞體積分布寬度),HDW(紅細胞血紅蛋白分布寬度)等參數。

由于血小板和紅細胞體積的明顯差異,很容易用一個限定閾值將兩者同時測得的光電信號區分。因此,迄今為止全血分析中血小板,紅細胞檢查均采用一個共用的分析系統。但由于血小板和紅細胞測量信號常有交叉,如大血小板的脈沖信號可能被誤認為紅細胞而計數,小紅細胞的脈沖信號可能進入血小板通道,造成實驗誤差。各血液分析儀生產廠家采用多種先進技術以減少血小板計數的干擾,以下我們就分別給予介紹:

掃流技術(sweep flow):由于血小板和紅細胞在同一個計數池中計數,紅細胞體積較大,在通過正中計數感應區時會形成一個大脈沖,若有回流會同時又產生一個因渦流再度進入感應區邊緣而形成的小脈沖使電極可能感應到相當于血小板大小的小脈沖,使血小板計數假性增多。掃流技術是在進行紅細胞和血小板計數的同時,在紅細胞計數小孔的后面有一個穩定的液流通過,這樣可以使后的紅細胞被立即沖走,以防止回到感應區被計數為血小板。

傳統血液學常規檢查方法是借助于顯微鏡進行人工血液紅細胞、白細胞計數和血涂片染色后顯微鏡進行肉眼人工白細胞分類，每檢測一份標本至少要20分鐘才能出檢測報告，不僅檢測項目少，且費時費力，準確性、可靠性受到一定影響，難以進行質量控制。到20 世紀50 年代血細胞分析儀(Automated Heamatology Analyzer)問世以來，血細胞自動分析從單一的電阻抗技術發展成為多種技術的融合包括物理學、化學、免疫學、流式細胞術、信息處理技術、如體積傳導光散射（VCS）、多角度偏振光散射（MAPSS）等，使對各種血細胞分析結果更加準確可靠；自動化方面，血細胞自動分析已由單一半自動不分類到的三分群/五分類（3/5-part differential）發展為血細胞自動分析的流水線，即將全血細胞計數（CBC）、網織紅細胞（Ret）計數、外周血推片和染色等過程實現全自動化，臨床應用方面，血細胞自動分析的檢測參數由單一的血細胞計數結果發展為可向臨床診斷，鑒別診斷、治療和預后監測提供數二十多個參數。

近年來，我國在血液自動分析領域也取得了十分可喜的成績。目前，各級醫院、鄉鎮、社區醫療機構血液分析儀已逐步得到普及，CBC 檢測結果的精密度和準確度明顯提高；大中型醫院檢驗科擁有多臺血液分析儀，有的大型或教學醫院還擁有血液自動分析的流水線；同時，各級醫院已基本建立血液自動分析的質控程序，大大提高了全血細胞計數（CBC）的工作效率。

第二節 血液分析儀的發展歷程
近年來，隨著先進儀器的普及應用和技術人員素質的提高，我國的檢驗醫學事業有了飛速的發展。近10 年來，各種類型的血液分析儀在國內迅速普及。血液分析儀的應用，不但提高了檢驗結果的質量和工作效率，而且為臨床提供了更多更可靠的試驗指標，對疾病的診斷和鑒別診斷起了重要的作用。同時也取得了較好的經濟效益和社會效益。

一、血液分析儀的發展
傳統的血液學檢查：顯微鏡手工檢驗法。血細胞計數、白細胞分類結果準確性、可靠性受到一定影響，檢驗人員費時費力。1947 年美國科學家庫爾特（W.H.Coulter）發明了用電阻法計數粒子的ZL技術。1956 年他又將這一技術應用于血細胞計數獲得成功，其原理是根據血細胞非傳導的性質，以電解質溶液中懸浮血細胞在通過計數小孔時引起的電阻變化進行檢測為基礎，進行血細胞計數和體積測定，這種方法稱為電阻法或庫爾特原理。60 年代末血細胞分析儀除可進行血細胞計數外，還可以同時測定HBG 血紅蛋白。70 年代計算機技術快速發展，將血小板計數的繁瑣手續（手工分離富血小板血漿后在進行血小板計數），改進成血小板與紅細胞同時計數。80 年代，發展迅速，在8 項檢測基礎上加上紅細胞指數、三個直方圖的報告，不僅提供是否貧血，且可對貧血的類型和原因進行分析；血小板參數對止血和血栓疾病的診斷及一些疾病的療效觀察有重要價值。開發了白細胞3 分群血細胞分析儀。90 年代，開發出五分類血液分析儀和可對網狀紅細胞進行計數的血細胞分析儀，同時，將激光、射頻、化學染色計數應用于對細胞檢測更成熟，發展成為血液分析流水線。

二．白細胞分類技術的進展
最早進行白細胞分類的設備僅根據白細胞的體積分布情況將淋巴細胞單獨劃分出來。在1970 年起Coulter 公司開始設計對白細胞進行分類的儀器，并首先推出了二分類的S-PLUS 系列儀器，然后在1980 年又推出了T 系列，都是可進行白細胞二分群的儀器，大家比較熟悉的SysmexF800 和F820 型也是根據白細胞體積分布直方圖進行粗略兩分類的儀器。目前半自動或全自動型具有18 參數含白細胞三分類的血細胞分析儀已經成為我國醫院檢驗科的主流血細胞分析儀。僅僅根據簡單的體積分析法就將血細胞進行分類，無論是三分類（3-partdifferential）還是二分類（2- partdifferential），其實是將細胞按照體積大小進行了簡單的分群處理，實際上是不科學的，因此國內專家建議將此分類統一稱呼為分群（group），即二分群型或三分群型血細胞分析儀。

第三節 現代血液分析儀的主要進展
隨著高科技的應用和基礎醫學的發展，各種先進的血細胞分析測試技術被應用到血液分析儀上。1987 年Coulter 公司發明的VCS(Volume，V，體積；conductivity，C，電導性；Scatter，S，光散射)技術可使血細胞未經任何處理，在與體內形態完全相同的自然狀態下得出檢測結果。而在SYSMEX 的NE-8000和SF-3000 血細胞分析儀中采用了阻抗和射頻技術聯合的白細胞分類法。進入90 年代后，儀器的自動化程度增高(達到120 份/小時)；可進行多參數分析(高達30 余項)；精密度高(重復計數；保證微孔管清潔；取中段血；運動流式細胞計數原理；鞘流原理……)；向5 分類及鑒別幼稚細胞發展；準確度好，全面質量管理，保證儀器檢測可靠性；具有智能化，可對同一病人診斷的前后進行對比，提出綜合意見，確定診斷方向；更加注意保護操作人員的安全(SLS-Hb、自動混勻、進樣、吸樣針內外清洗等)；向流水線發展，將血液分析儀、網織紅細胞計數儀、推片、染色機聯成流水操作線。

第四節 血液分析儀白細胞五分類法原理和散點圖特征
一、簡要發展史
1974 年，一種名為HEMALOG D 的具有初步白細胞分類功能的白細胞分析儀問世。1982 年，Technicon 公司生產了H6000 型血液細胞分析儀器，應該是首款具有白細胞五分類能力的儀器。同時代日本日立公司推出圖像分析法的白細胞分析儀HITACHI 8200 型，僅僅是用于完成白細胞血片分類的儀器，沒有其他血細胞計數分析能力。Technicon 公司1985 年開發了比較成熟的具有白細胞五分類功能的Technicon H1 型血液細胞分析儀，隨后升級為H2 型和H3 型。COULTER 公司在1987 年開發研制其經典VCS 技術，并推出持續具有多年影響力的、具有白細胞五分類功能的血液細胞分析儀MAXM 型。

1990 年前后，歐洲和日本許多廠家都陸續推出了各種類型的具有白細胞五分類功能的血液分析儀。各廠家設計生產的此類血細胞分析儀，其在白細胞分類技術上原理各不相同，分析測定項目略有不同，且形式多樣，結構復雜，試劑種類和成分也趨于復雜。不斷改進和升級的新產品使得儀器在白細胞分類技術上更加成熟和可靠。而技術的提高也帶來了儀器和消耗品（試劑）價格的增加。

二、儀器原理和散點圖特點
1、體積、電導和激光散射原理
這是Beckman－Coulter 公司生產的血液分析儀所采用的經典分析方法，他集三種物理學檢測技術于一體，在細胞處于自然原始的狀態下對其進行多參數分析。該方法也稱為體積、電導、激光散射血細胞分析法。此技術采用在標本中首先加入紅細胞溶血劑溶解掉紅細胞，然后加入穩定劑來中和紅細胞溶解劑的作用，使白細胞表面、胞漿和細胞體積保持穩定不變。然后應用鞘流技術將細胞推進到流動細胞計數池（Flowcell）中，接受儀器VCS 三種技術的檢測。V 代表體積（Volume）測量法，是采用經典的庫爾特ZL技術，用低頻電流準確分析細胞體積。體積是區分白細胞亞群的一個重要的參數，它可有效區分體積大小差異顯著的淋巴細胞和單核細胞。C 代表高頻電導性（Conductivity），采用高頻電磁探針原理測量細胞內部結構間的差異，也是該公司的ZL技術。

細胞膜對高頻電流具有傳導性，當電流通過細胞時，細胞核的化學組份可使電流的傳導性產生變化，其變化量可以反映出細胞內含物的信息。該參數可用來區分體積相近而內部性質不同的細胞群體，如淋巴細胞和嗜堿性粒細胞，由于它們的細胞核特性不同而在傳導性參數上有所區別。S 代表激光散射（Scatter）測量技術，采用氦氖激光源發出的單色激光掃描每個細胞，收集細胞在10°～70°角度內出現的散射光(MALS)信號。該激光束可穿透細胞，探測細胞內核分葉狀況和胞漿中的顆粒情況，提供有關細胞顆粒性的信息，可以區分出顆粒特性不同的細胞群體。例如細胞內顆粒粗的要比顆粒細的散射光更強，因此可以用于區分粒細胞中的嗜中性、嗜酸性和嗜堿性三種細胞。

儀器將分析每個細胞在V、C、S 三種檢測技術上的測量結果，因為不同類別的細胞會在體積、表面特征、內部結構等方面呈現明顯的不同。將這些特征性信息被定義到以VCS 為三維坐標(分辨率為256×256×256=16,777,216)所形成的立體散點圖中，這五類細胞可在三維空間中形成特定的細胞群。通過計算某群細胞數量占白細胞總數的百分比，即可得到五項白細胞分類結果。儀器不僅僅做出對正常白細胞的五項分類結果，給出典型的散點圖型，還可以提示許多異常細胞區域的報警。

VCS 技術可通過DF1、DF2、DF3 三個散點圖將五種類型白細胞明顯區分開。三個散點圖的縱坐標均定義為細胞體積。DF1 為細胞體積和激光散射的直方圖，DF2 和DF3 為細胞體積和高頻電導性的直方圖，DF3 為除去粒細胞群體后顯示出淋巴細胞后面的嗜堿性粒細胞圖像。VCS 技術是Beckman－Coulter 公司開發研制的經典專有方法，到目前為止的各種高檔血細胞分析儀均采用該方法對白細胞進行分析。該方法在白細胞分析上尚有特殊能力，例如可以測定和分析中性粒細胞的體積、核漿比例、細胞顆粒特性等參數，也就是將中性粒細胞的VCS 三個參數分別給出，用于了解細菌感性疾病與其它疾病的區別。也可對淋巴細胞、單核細胞等均作出其細胞群體的三個技術參數值，是比較有前景的研究內容。

儀器在RBC、PLT、WBC 計數上依然采用電阻抗法，血紅蛋白仍然采用比色法測定。該公司的五分類法血細胞分析儀先后推出多種類型，如MAXM、STKS、GEN·S、HmX、LH755 和最新的LH780 等型號，在某些機型還具有網織紅細胞分析功能和T 淋巴細胞亞群分析功能。

2、電阻抗、射頻和細胞化學技術
日本Sysmex 公司系列血液分析儀是在國內應用非常廣泛的儀器，從三分類法到五分類法的各種型號儀器都有大量用戶。其儀器型號種類豐富，功能和測定參數各異，其各種儀器間均有近似的檢測原理，但在結合特定的功能以達到不同的分析目的方面，其原理和所用試劑又有不完全相同之處。以XE-2100型血細胞分析儀為例說明其在白細胞計數和分類方面的原理和特點。

Sysmex XE-2100 在白細胞分類上采用半導體激光流式細胞技術結合核酸熒光染色技術進行白細胞計數和分類。半導體激光照射在通過鞘流技術處理的細
胞上，可根據每個細胞所產生的三種信號來鑒別細胞類別。前向散射光（FSC）信號可反應細胞體積大小；側向散射光（SSC）信號可反應細胞的顆粒和細胞核
等內含物的信息；側向熒光（SFL）強度信號則用于分析細胞內脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的含量。

在白細胞分析上主要采用兩個通道進行細胞計數和分類，兩個通道均采用激光和鞘流進樣的方式測定。DIFF 通道： STROMATOLYSER-4DL 試劑中的表面活性劑可以溶解掉標本中的紅細胞和血小板，并在白細胞膜上打出小孔；然后第二種試劑STROMATOLYSER-4DS 中的聚次甲基染料通過這個小孔進入白細胞中，與細胞核的核酸和細胞器結合，在經過波長633nm 的激光照射，產生的熒光強度與細胞的核酸含量成正比。STROMATOLYSER -4DL 試劑還具有與嗜酸性顆粒特異性結合的能力，可根據側向散射光信號強度，將嗜酸性粒細胞從中性粒細胞中分離出來。這樣可以將中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞清楚的分離開。在DIFF 散射圖當中可以得到白細胞的四個分群（LMNE）。

WBC/BASO 通道是專用作檢測嗜堿性粒細胞的通道，因為嗜堿性粒細胞數量非常少，因此必須采用特殊技術處理。STROMATOLYSER –FB 是一種酸性試劑，可將紅細胞和血小板形成淡影化，將除嗜堿性粒細胞以外的白細胞處理成裸核形態，然后采用前向散射光（FSC）信號和側向散射光（SSC）信號使嗜堿性粒細胞從其它細胞中分離出來。前向散射光與細胞體積測定相關，側向散射光與裸核后的細胞結構復雜性有關。在這個通道中可以獲得白細胞總數和嗜堿性粒細胞的數量。
儀器在幼稚粒細胞分析上有特殊的IMI 通道，在IMI 檢測通道中主要應用射頻（RF）技術和直流電阻抗法（DC）。這個測定通道根據幼稚細胞膜表面比成熟細胞膜表面含有脂質少的現象，在稀釋液中加入硫化氨基酸（IM 試劑），由于占位不同，結合在幼稚細胞表面的氨基酸較多，對溶血劑有抵抗作用，對幼稚細胞具有保護作用。當加入溶血劑后成熟細胞易被溶解掉，而幼稚細胞不易被溶解破壞，可通過電阻法檢測出來。射頻技術用于測量細胞核的大小和顆粒的多少，而直流電信號可反應出細胞體積的大小。

在有核紅細胞計數上通過專門的有核紅細胞檢測程序和專用通道-NRBC 通道，在處理標本時加入STROMATOLYSER－NR 專用試劑，它能使成熟紅細胞溶解
又可保持有核紅細胞的核結構，同時也將白細胞保持完好。STROMATOLYSER－NR試劑中的聚次甲基熒光染料可滲透進入白細胞膜內，將白細胞和有核紅細胞的核染色。通過檢測熒光強度得到：白細胞核大熒光強度高，有核紅細胞核小，熒光強度低，正常紅細胞無細胞核和破碎，熒光強度極低。根據熒光強度差和前向散射光信號測定的細胞體積差，可將有核紅細胞從其他細胞群中區分出來。該儀器在紅細胞和血小板的計數和分析上仍然沿用了經典的電阻抗方法，在血紅蛋白測定上采用了無劇毒物質的SLS 溶血劑比色法。