以硅膜為基礎純化PCR產物實驗方法

發布時間：2019-09-12 18:43 原文鏈接：以硅膜為基礎純化PCR產物實驗方法

試劑、試劑盒	乙醇 PCR 樣品
儀器、耗材	真空裝置真空泵真空廢物收集裝置真空管 PCR 純化系統
實驗步驟	一、材料 1. 緩沖液、溶液和試劑乙醇，80%(75 ml/板；使用前配制） 2. 核酸和寡核苷酸在 96 孔板中的 PCR 樣品（每樣品 20?lOOul) 3. 特殊設備 Vac-man96 真空裝置（Promega) 或類似真空裝置能產生 15?20in(lin=2.54 cm) 汞柱壓力的真空泵真空廢物收集裝置（1L 規格）真空管 4. 其他 WizardSV96PCR 純化系統（Promega; 包括結合板、收集板、DNA 洗脫板、膜結合液和無核酸酶的水）二、方法 1. 如圖 9-8 所示準備真空裝置。將結合板放置于真空裝置底部。為了確保樣品板上的孔與結合板上的孔一一對應，把結合板上有數字標記的一側朝向真空裝置中的真空口端，在真空裝置基部的真空口處貼上一條真空標記線。 2. 向 96 孔板的每個 PCR 樣品中加入相同體積的膜結合液（如在每 lOOulPCR 樣品中加 100ul 膜結合液）。 3. 抽吸混合，將全部樣品轉移到放置在真空裝置上部的結合板的孔中，室溫下溫 lmin。 4. 抽真空直到樣品通過結合板（約 30s), 釋放真空。 5. 向結合板的每個孔中加入 200ul80% 乙酹，室溫下溫育 1 min，抽真空直到乙酵通過結合板（約 30s)，釋放真空。 6. 重復步驟 5 以使 200ul 80% 乙醇洗滌的次數達到 3 次。 7. 最后一次洗滌中，當結合板的孔變空后，繼續抽真空 4 min 使結合基質干燥。 8. 關閉真空，松開真空裝置底部的真空線并使之猛吸入位于真空裝置墊圈內的其空端口中。從真空裝置基部移開結合板，在干凈紙巾上輕拍使之干燥并除去殘留的乙酵。 9. 將 96 孔 U 形底的收集板放置于真空裝置底床中，上面裝上真空裝置墊圈，要把形底收集板有數字標記的一邊朝向真空端口。 10. 如圖 9-8 所示，將結合板放置在真空裝置墊圈和收集板之上，結合板的尖端必須對準收集板孔的中央，兩板必須同向。向結合板每孔加 l00ul 無核酸酶的水，室溫下溫育1min，抽真空直到溶液通過板（約 1min)。 11. 釋放真空并取出結合板，小心移開真空裝置墊圈，確保收集板仍位于真空裝置床中。如收集板壁仍留存有小液滴，短時間離心板以將小液滴集中到孔底。洗出液的體積可能不同，大約為 75ml。展開

試劑、試劑盒

乙醇 PCR 樣品

儀器、耗材

真空裝置真空泵真空廢物收集裝置真空管 PCR 純化系統

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

乙醇，80%(75 ml/板；使用前配制）

2. 核酸和寡核苷酸

在 96 孔板中的 PCR 樣品（每樣品 20?lOOul)

3. 特殊設備

Vac-man96 真空裝置（Promega) 或類似真空裝置

能產生 15?20in(lin=2.54 cm) 汞柱壓力的真空泵

真空廢物收集裝置（1L 規格）

真空管

4. 其他

WizardSV96PCR 純化系統（Promega; 包括結合板、收集板、DNA 洗脫板、膜結合液和無核酸酶的水）

二、方法

1. 如圖 9-8 所示準備真空裝置。將結合板放置于真空裝置底部。為了確保樣品板上的孔與結合板上的孔一一對應，把結合板上有數字標記的一側朝向真空裝置中的真空口端，在真空裝置基部的真空口處貼上一條真空標記線。

2. 向 96 孔板的每個 PCR 樣品中加入相同體積的膜結合液（如在每 lOOulPCR 樣品中加 100ul 膜結合液）。

3. 抽吸混合，將全部樣品轉移到放置在真空裝置上部的結合板的孔中，室溫下溫 lmin。

4. 抽真空直到樣品通過結合板（約 30s), 釋放真空。

5. 向結合板的每個孔中加入 200ul80% 乙酹，室溫下溫育 1 min，抽真空直到乙酵通過結合板（約 30s)，釋放真空。

6. 重復步驟 5 以使 200ul 80% 乙醇洗滌的次數達到 3 次。

7. 最后一次洗滌中，當結合板的孔變空后，繼續抽真空 4 min 使結合基質干燥。

8. 關閉真空，松開真空裝置底部的真空線并使之猛吸入位于真空裝置墊圈內的其空端口中。從真空裝置基部移開結合板，在干凈紙巾上輕拍使之干燥并除去殘留的乙酵。

9. 將 96 孔 U 形底的收集板放置于真空裝置底床中，上面裝上真空裝置墊圈，要把形底收集板有數字標記的一邊朝向真空端口。

10. 如圖 9-8 所示，將結合板放置在真空裝置墊圈和收集板之上，結合板的尖端必須對準收集板孔的中央，兩板必須同向。向結合板每孔加 l00ul 無核酸酶的水，室溫下溫育1min，抽真空直到溶液通過板（約 1min)。

11. 釋放真空并取出結合板，小心移開真空裝置墊圈，確保收集板仍位于真空裝置床中。如收集板壁仍留存有小液滴，短時間離心板以將小液滴集中到孔底。洗出液的體積可能不同，大約為 75ml。