用單細胞質譜流式技術“繪制”乳腺癌微生態系統圖譜

　　乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，也是女性癌癥死亡的主要原因【1】。目前臨床工作中尚未實現乳腺癌完全意義上的精準治療，很大程度是因為對腫瘤微生態系統的了解不夠充分。腫瘤微生態系統是由癌細胞，浸潤性免疫細胞，基質細胞和其他細胞類型以及非細胞組織成分所構成【2】。由于各種遺傳或者非遺傳的因素，癌細胞以及腫瘤相關細胞在細胞表型功能上差別很大。目前在臨床具體診療過程中，通過腫瘤細胞表面是否表達ER（雌激素受體）, PR（孕激素受體）, HER2（人表皮生長因子受體2）, 和Ki-67（細胞增殖的標志物）等將乳腺癌分為luminal A，luminal B，luminal B-HER2+，HER2+和三陰型乳腺癌等5類【3】。通過上述分型進行針對性的治療，能夠總體提升臨床治療的效果。然而，即便如此，同類型的乳腺癌患者對相同治療方案的敏感性差異很大。因此，基于腫瘤微生態系統的差異，通過單細胞蛋白組學的方法對乳腺癌進行更加細致準確的分型有助于解決上述的差異性療效的問題，為臨床提供更優的精準治療方案。

　　2019年4月11日，來自于蘇黎世大學分子生命科學研究所的Johanna Wagner等在 Cell 發表題目為：A Single-Cell Atlas of the Tumor and Immune Ecosystem of Human Breast Cancer的文章。他們采用了單細胞蛋白組學研究的理念，通過質譜流式細胞技術（Mass Cytometry）的方法，檢測了數千萬個細胞，這些細胞分別來自于144例乳腺癌患者的腫瘤組織（基本覆蓋所有臨床亞型），46例癌旁組織和4例通過乳腺成形術得到的正常乳腺組織。結果表明不同乳腺癌患者腫瘤微生態系統存在明顯差異，該差異與相應腫瘤患者的預后顯著相關，基于上述結果在將來或許可以為臨床治療提供更優的精準治療方案。

　　作者首先講述了使用質譜流式細胞技術“繪制”人類乳腺癌腫瘤微生態系統圖譜的實驗方案（圖1）。具體來說，作者在收集好相應的腫瘤組織和非腫瘤組織標本后，制備成單細胞懸液，對這些單細胞懸液標記了73種抗體后通過質譜流式細胞技術的方法檢測了大約2600萬個細胞，然后通過相應的統計分析方法進行分析。結果發現，在傳統分型一致的情況下，由于遺傳或者非遺傳的因素，腫瘤細胞和免疫細胞等組成的腫瘤微生態系統在不同個體腫瘤組織中間有很明顯的差別，反映了腫瘤微生態系統內部的一種復雜的狀態。

圖1 全文圖解摘要

　　通過上述方法，對這些組織標本中的腫瘤細胞和免疫細胞進行表型分析后結果表明，腫瘤組織中存在著大量的T淋巴細胞和骨髓來源的細胞。深度挖掘數據，使用t-SNE 以及PhenoGraph的方法對這些T細胞表型進行分析，基于CD4和CD8a分子，和FOXP3，CCR7等15個表面marker，分別將CD4 T細胞細和CD8 T細胞各分為10個類型，隨后比較了腫瘤組織和正常組織中這些類型的T細胞所占的比例。同時作者對腫瘤浸潤性巨噬細胞（TAM）也基于不同的表面標志物進行了分類，分為5大類，這5大類TAM中包含表型差異的19小類TAM，同樣也比較了這些不同類型的TAM在腫瘤組織和正常組織之間的差異。在T細胞和TAM細胞中作者重點分析了誘導T細胞耗竭的相關因子如PD-1，CTLA-4，CD38和TIM-3等分子，以及這些分子的配體在不同組織中T細胞和TAM之間表達的差異，并且對上述抑制性分子與腫瘤預后進行了相關分析。作者發現PD-L1+的TAMs和耗竭的無功能的T細胞在ER受體陽性亦或是ER陰性的高危患者標本中數量較多，表明了這些抑制性分子與腫瘤的不良預后密切相關。

　　隨后作者通過對不同來源的乳腺癌標本以及對照標本中的上皮細胞來源的腫瘤細胞進行分型，同樣使用t-SNE 以及PhenoGraph的分析方法，作者根據30種不同的表面標志物所構成的不同組合形式，將乳腺癌上皮細胞分為45群，分別表示為Ep01–Ep45，隨后將這45群細胞歸納為7種Luminal類型，表示為L1-L7，以及2種基礎類型B1和B2。在分群后，使用L1-L7以及B1,B2分型與臨床中目前普遍采用的Luminal分型進行對比分析，將所有數據進行深度挖掘。通過上述的腫瘤細胞分型，作者發現腫瘤組織的上皮細胞表型比正常組織有明顯多樣化的特點。但是即便如此，在每個患者的腫瘤中依然有占有絕對數量優勢的某一種腫瘤細胞類型存在。而這種優勢類型腫瘤細胞的差異就是腫瘤治療差異性不良預后以及耐藥產生的重要原因。

圖2：Ep01-Ep45；L1-L7,B1,B2

　　作者還發現， ERa+的細胞在ER+型的腫瘤患者中數量差別明顯，在Luminal B型腫瘤中ERa+腫瘤細胞的數量與PD-L1陽性的TAM以及耗竭T細胞的數量具有顯著的相關性。表明腫瘤細胞的表型與腫瘤浸潤性免疫細胞的表型存在相互影響相互干擾的情況，它們相互作用，形成了各自特有的腫瘤微生態系統。

　　綜上所述，作者采用單細胞蛋白組學，通過質譜流式細胞技術結合大數據統計分析的方法對乳腺癌腫瘤組織進行分析，描繪出了乳腺癌組織的腫瘤微生態系統。作者提出乳腺癌的分型不能僅僅局限于腫瘤細胞的表型，同時應該將腫瘤浸潤性免疫細胞的表型考慮在內，因為在腫瘤微生態系統中，腫瘤細胞和免疫細胞是互相影響，協同促進的。這一理念將為今后乳腺癌的精準治療提供了依據和方法。

　　1. Torre, L.A., Islami, F., Siegel, R.L., Ward, E.M., and Jemal, A. (2017). Global cancer in women: Burden and trends. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 26, 444–457.

　　2. McAllister, S.S., and Weinberg, R.A. (2010). Tumor-host interactions: a farreaching relationship. J. Clin. Oncol. 28, 4022–4028.

　　3. Perou, C.M., S?rlie, T., Eisen, M.B., van de Rijn, M., Jeffrey, S.S., Rees, C.A., Pollack, J.R., Ross, D.T., Johnsen, H., Akslen, L.A., et al. (2000). Molecular portraits of human breast tumours. Nature 406, 747–752.