分子信標的設計
分子信標（Tyagi and Kramer 1996) 是另一種特異的熒光實時 PCR 探針（圖 1), 這種分子信標可以在體內和體外動態地、實時地檢測核酸 雜交事件（Tyagi and Kramer 1996; Kostrikis et al. 1998; Tyagietal. 1998)。
圖1
分子信標是一段雙重標記的寡核苷酸（25~40nt）形成具有一個環（探針）和一個自身互補的莖的發夾結構。熒光報告分子在 5'端，猝滅劑在 3'端。
室溫條件下，分子信標形成發夾結構，熒光報告物質和猝滅劑分子通過探針自身互補形成的莖結構緊靠在一起，因此抑 制了熒光信號。
當 PCR 退火時，如果探針遇到靶 DNA 序列，根據熱力學原理，信標將優先和靶 DNA 結合而 不是形成發夾結構。由于莖結構被破壞，熒光報告物質 與猝滅劑相互分離，報告物質得以發射熒光（見圖1)。
傳統的寡核苷酸雜交必須淸除未雜交的探針分子，以消除背景影響。利用分子信標的雜交在沒有靶 DNA 存在的情況下熒光劑與猝滅劑可以穩定地結合在一起，不發射熒光，因而 背景很低。因此，可以省略清洗探針這一步，而且，隨著擴增的進行，分子信標結合于靶 DNA 的比例逐漸增加，發射的熒光逐漸增強，因此熒光強度與 PCR 產物的累加是直接相 關的。
由于莖環結構很穩定，分子信標與線性 探針相比具有較高的選擇能力，可以對只有一個 核苷酸差異的靶序列進行辨別，使其成為研究單核苷酸多態性（SNP） 的理想工具。完全匹 配的探針-靶 DNA 復合體比分子信標單鏈形成的發夾結構更為穩定，而發生錯配的探針-靶 DNA 復合體一般不太穩定，即使只有一個堿基對的錯配也如此，這一熱力學特征是分子信 標高度特異性的基礎。
分子信標在許多定性和定量檢測研究中 應用越來越廣泛。它被用于實時檢測 DNA 擴增量的實時 PCR (TyagiandKramer 1996) 它可以用多種染料標記，用來進行實時熒光基因型鑒定（Kostrikisetal. 1998; Tyagietal. 1998) 和在醫療診斷時同時檢測樣品中不同的病原體（Vet etal. 1999)。
分子信標也可以在活體細胞中檢測 RNA 轉錄物（Sokol et al. 1998)、檢測 DNA 結合蛋白（HeydUkandHeyduk 2002)。分子信標還可以應用于實時 PCR、端點 PCR 和 RT-PCR 實驗。
1. 設計路線
為了成功地檢測 PCR, 分子信標必須在退火溫度與靶 DNA 結合，而未結合的探針則保 持閉合的無熒光狀態。退火溫度和緩沖液會影響探針的特異性，師兄（師兄微信號：shixiongcoming）覺得這個必須要認真處理。loop 環（即探針區）應具有靶特異性，兩側可以形成發夾結構的互補序列。設計信標時，通常應遵循以下路線。
（1）探針區應為 15~33bp 長，且環序列必須與靶 DNA 序列互補。
（2）探針區的 Tm 值應該比 PCR 的退火溫度髙 7~10 倍 (參照 GC 含量預測規則），而且 要在附加莖結構序列之前單獨估測探針序列。
（3） 為了保證信標優先與靶序列雜交，探針必須與靶序列二級結構較少的區域互補。靶 DNA 的二級結構用序列分析軟件分析，如 UNAFold(Michael Zuker，Rensselaer Polytechnic Institute, Http: //www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/)。
（4）分子信標應該結合于或靠近復制子的中間，上游引物 3'端和分子信標探針 5'端（莖）之間應大于 6bp。
（5）分子信標的莖區長度應為 5.7bp, GC 含量控制在 70%.80%, 莖部太長會使探針 與靶 DNA 結合速度減緩。
（6）莖區的長度、序列和 GC 含量應慎重選擇，保證其解鏈溫度比 PCR 引物的退火溫度 髙 7~10°C
（7） 莖區解鏈溫度一般用 Mfold 發夾折疊公式計算（UNAfold 軟件的一部分），該公式用來 估測形成莖區雙鏈分子的自由能，進而預測其解鏈溫度。假如 GC 含量是 100%, 5bp 長的 莖的解鏈溫度介于 55~60°C，6bp 長的莖的解鏈溫度介于 60~65°C, 7bp 長的莖的解鏈溫 度介于 65~70°C。
（8）一個序列的自由能越負，越優先形成發夾結構，而且越穩定。用 Mfold 得到的發夾 結構的自由能應介于 -3~ 0.5 kcal/mol (lcal=4.1840J) 之間。
（9）由于 G 堿基可以猝滅熒光，因此要避免 G 堿基與熒光染料（一般在莖區 5'端）直接毗鄰，莖區 5'端為 C 較好。
（10）設計好的探針要檢測是否存在其他二級結構而不是預先設計好的發夾結構，因為這 樣會改變熒光染料與猝滅劑之間的相對距離，導致背景信號增強。
（11）要避免探針與引物之間互補，否則會導致引物與探針雜交，使背景增加。
（12）在分子信標 PCR 擴增中，復制子應相對較短，一般小于 150bp。分子信標是一種內在探針，必須與靶序列的互補鏈競爭。較短的復制子更容易完成 DNA 合成，以保證粑序列 完全合成，因此結果更為可靠。
2. 熒光團和猝滅劑的選擇
在分子信標設計過程中，另一個需要考慮的因素是熒光標記物和猝滅劑。ciabcyl 【（4-二甲氨基苯基偶氮）安息香酸】是分子信標的首選猝滅劑，dabcyl 是一種中性疏水性分子，是多種熒光標記物的理想「伴侶」。與信標探針的總長度相比，ciabcyl 猝滅熒光探針的 作用范圍很窄，這就意味著它必須與熒光團非常靠近才能有效地猝滅熒光，從而保證發夾結 構信標不發射熒光，而當探針與靶 DNA 形成復合體時會發出熒光。
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參考文獻：
蒂芬巴赫.「PCR實驗技術指南」
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Vet J.A., Majithia A.R., Marras S.A.E., Tyagi S., Dube S., Poiesz B.J., and Kramer F.R. 1999. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proc. Sci. 96:6394-6399.