類似方案 1、方案 2 描述了在真核表達載體上進行 cDNA 文庫構建與篩選的方法, 流程分為以下兩個階段：1. 在真核表達載體上構建 cDNA 文庫；2. 在真核表達載體上構建的 cDNA 文庫的篩選。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。
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| 實驗材料 | 宿主細胞質粒或λ噬菌體表達載體包裝提取物電轉化感受態大腸桿菌 |
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| 試劑、試劑盒 | 限制性內切核酸酶緩沖液限制性內切核酸酶通過 poly(A)+富集的 mRNAcDNA 文庫含適當抗生素的 Terrific 球脂平板含適當抗生素的 Terrific 肉湯培養基 |
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| 儀器、耗材 | cDNA 合成試劑盒 |
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| 實驗步驟 | 階段一：在真核表達載體上構建 cDNA 文庫
材料
緩沖液與溶液
10X 限制性內切核酸酶緩沖液
酶及緩沖液
限制性內切核酸酶
見步驟 3
核酸與寡核苷酸
通過 poly(A)+富集的 mRNA
mRNA 須提取自表達目標蛋自活性的細胞或組織，并經兩輪 oligo(dT)-纖維素親和層析純化（見第 7 章，方案 3)。鑒定目標蛋白高表達組織或細胞系的方法應與表達克隆中的篩選方法相同。獲知目標 mRNA 的大小對于表達克隆非常有益，可對 mRNA 進行分級分離，然后檢測不同大小組分的翻譯產物中靶標蛋白生物學活性以確定這一交分級分離的 mRMA 組分可注射入卵母細胞進而檢測卵中靶標蛋白的活性，或者也可將 mRNA 組分轉染培養的哺乳動物細胞（見第 16 章)。
專用設備
cDNA 合成試劑盒
多家生產商供應此試劑盒，其中通常包括制備 cDNA 庫并將其連接λ噬菌體或質粒載體中所需的全部試劑（見信息攔"商品化的 cDNA 合成及文庫構建試刑盒")。
附加試劑
本方案步驟 1 需要的試劑列在方案 1 階段 1~4。
本方案步驟 2 需要的試劑列在方案 1 階段 5。
本方案步驟 4 和 5 需要的試劑列在方案 1 階段 6。
本方案步驟 8 可能需要列在第一章方案 26 的試劑。
載體與菌株
電轉化感受態大腸桿菌
如選擇質粒表達載體，制備（見第 1 章，方案 26) 或購買電轉化感受態大腸桿菌作為 cDNA 文庫的宿主細胞。轉化效率至少應達到 5x108 克隆/ul 質粒 DNA。最好在表達克隆及篩選過程中只使用同一批制備的感受態細菌。
包裝提取物
如選擇λ噬菌體載體，則購買（或制備）髙滴度的包裝提取物，用于將重組 cDNA 包裝λ病毒顆粒中 (見信息欄“體外包裝”)。包裝提取物的滴度至少應達到109pfu/ug 病毒 DNA。
質粒或λ噬菌體表達載體
載體的選擇取決于表達所用的宿主系統。如宿主是爪蟾卵母細胞，表達載體應選擇λ菌體栽體成者在多克隆位點附近帶有來源于 Sp6、T3 或 T7 噬菌體啟動于的質粒載體（如表達載體λZAP Express、λExCell 和 pSPORT）。如使用哺乳動物細胞作為宿主，則選擇帶有強啟動子（如人巨細胞病毒早期瞬時啟動子）的質粒載體，并且帶有強轉錄終止序列（如人生長激素基因 3'端序列或 SV40 晚期終止子序列）。這樣的質粒包括 pCMV 系列質粒和質粒 pcDNA4(見表 11-5 和附錄 3)。
方法
1. 用商品化試劑盒或按方案 1(階段1~4)制備平末端的雙鏈cDNA, 并在末端連接上合適的接頭或銜接子。
2. 使用凝膠過濾層析按大小分級分離雙鏈cDNA。細則參見方案 1 階段5。
如目標mRNA大小已知，收集柱層析產物介于目標mRNA大小=1kb的組分。如大小未知，則將柱層析產物按以下大小分別收集：500~1500bp,1500~3000bp以及>300bp。
3. 雙酶切 10~25ug 的質粒或λ噬菌體表達載體，cDNA 上接頭-銜接子區域 5'和 3'端應具有相應的黏性末端。
重要：應確保酶切完全。應依次酶切而不是同時雙酶切；酶切之間用酚: 氯仿抽提結合乙醇沉淀純化 DNA, 只要可能就采用凝膠電泳檢査酶切是否完全。
為確保在克隆之前表達載體的酶切完全，一些研究者在多克隆位點 SatⅠ和 NatⅠ(或其他雙酶切位點組合）之間插人一段 200~300bp 的塞子（stuffer) 序列。這樣酶切效率可隨時得到監測, 并在某些情況下可增強載體的雙酶切效果，因為多克隆位點區內的兩種限制酶切位點通常很接近，將它們分開 200~300bp 可以消除因此而引起的酶切末端抑制現象。
4. 按不同的 cDNA 與載體（噬菌體臂或質粒 DNA) 分子比例進行連接預實驗。優化連接反應過程細則參見本章方案1 中階段 6 導言部分（也可見于階段 6 的步驟 l）。
如已通過分級分離將 CDNA 分成大小不同的組分（見階段 2 注意事項)，則每一組分都必須分別進行連接反應效率檢測。
5. 將每一連接反應產物取小部分包裝λ噬菌體顆粒中。檢測每一包裝反應產生的感染顆粒的滴度。細則參見專欄“λ噬菌體在大腸桿菌菌株上鋪板”和方案1階段 6 之步驟 2~6。或者從每一連接反應產物中取小部分采用電穿孔法轉化大腸桿菌（見第 1 章方案 26)。
6. 檢測 6 個重組的λ噬菌體或質粒載體上的 cDNA 的大小是否合適，確定能產生最多重組克隆數的最佳連接反應 cDNA 與載體 DNA 比例，并計算按照此參數設置所構建的 cDNA 庫的豐度。
7. 按照最佳連接反應中 cDNA 插入物與載體分子的比例，連接盡可能多的 cDNA 與λ噬菌體或質粒 DNA。
通常設置許多小的連接反應體系，而不是一個較大的反應體系。
8. 使用下述方法之一制備并分析重組子：
如果使用λ噬菌體載體：按包裝提取物供應商提供的操作指南將連接產物 DNA 包裝入λ噬菌體顆粒中，測定病毒貯存液滴度，并將之保存于 4°C。
如果使用質粒載體：取小部分連接反應產物電轉化大腸桿菌以檢測連接反應產生的可能重組子數（參見第 1 章方案 26)。
9. 應盡快進行真核表達文庫的篩選。
階段 2: 在真核表達載體上構建的 cDNA 文庫的篩選
材料
緩沖液與溶液
貯存液，緩沖液和試劑組分見附錄 1, 按合適比例稀釋貯存液。
SM
酶和緩沖液
限制性內切核酸酶
特定的程序中所需要的限制性內切核酸。見步驟 1 和 3。
核苷酸與寡核苷酸
cDNA 文庫，按此方案中階段 1 所述制備
轉染/注射實驗的對照
在表達克隆中設置為陽性對照的 cDNA 的價值是難以估量的。如果可能，選擇編碼蛋白的生物活性與欲克隆的靶蛋白近似的 cDNA 作為對照。例如，欲克隆一個新的 K+通道蛋白的 cDNA, 則使用早先已克隆的 K+通道蛋白的 cDNA 作為陽性對照。對照 cDNA 用于確定合適的亞庫容量以及轉化/感染實驗參數設置是否恰當。在進行步驟 1 之前，必須將陽性對照 cDNA 轉入適當的大腸桿菌菌株（如使用質粒表達載體）或包裝入λ噬菌體顆粒。當使用爪蟾卵母細胞進行轉染/注射實驗時，必須引入兩個陰性對照：空載體質粒和不加模板 DNA 的轉錄反應體系組分。另外在步驟 1 中，包裝有菌體表達空載體的噬菌體顆粒或已轉人空表達載體質粒的大腸桿菌是必須的。
培養基
含適當抗生素的 Terrific 球脂平板
含適當抗生素的 Terrific 肉湯培養基（或其他豐富培養基)
附加試劑
本方案步驟 1 和步驟 2 可能需要商品化的質粒提取試劑盒（見第 1 章方案 9)。
本方案步驟 1 和步驟 3 可能需要第 16 章某一轉染方案所需的試劑。
本方案步驟 1 和步驟 3 可能需要的試劑列在第 9 章方案 6。
本方案步驟 1 和步驟 3 可能需要將 mRNA 注射入爪蟾卵母細胞的必需試劑，見 Spector 等（1998a)。
本方案步驟 1 可能需要的試劑列在第 2 章方案 1 或 5 以及方案 23 或 24。
本方案步驟 1 需要用于檢測陽性對照 cDNA 編碼蛋白質生物活性的必須試劑。
本方案步驟 2 可能需要的試劑列在第 1 章方案 26 和箏 2 章方案 1 以及方案 23 或 24。
本方案步驟 4 需要用于檢測靶蛋白生物活性的必須試劑。
本方案步驟 6 需要的試劑列在第 7、12、15 和 16 章。
細胞與組織
宿主細胞
卵母細胞取自雌性南非爪蟾，可從多處生物供應機構得到此種爪蟾（如 Carolina Biological Supply 或 Kons Scientific)。卵母細胞群表達注射入的 mRNA 的能力呈季節性變化，并受供體動物年齡和生理狀態的影響。表達 mRNA 時遇到的困難有時可通過更換動物的供應來源解決。卵母細胞的分離方法見 Colman(1984)，Spector 等（1998a) 和 Julius 等猴源的 COS 細胞或者 293 人胚胎腎細胞系的衍生細胞系由于其在轉染時具有極高的轉染效率而被選擇用于哺乳動物瞬時表達的宿主細胞（Gluzman1981;Gorman1990)。不過許多其他的細胞系（例如 CHO 和 NIH-3T3) 也曾成功的應用于此（Naglich et al.1992;Bates et al,1993;Young et al.1993)。
在進行表達克隆前，檢測未注射的卵母細胞或未轉化轉染細胞中靶標蛋白的生物學活性，應確保使用的表達宿主中靶蛋白活性處于幾乎檢測不到的水平。
方法
1. 設置一系列的預實驗，優化用于篩選文庫中目的 dDNA 克隆的轉染和表達系統。最好采用一個早先已克隆的 cDNA 進行優化實驗，并且已具備檢測此 cDNA 編碼的蛋白生物學活性的可靠方法。
如果使用真核質粒表達載體和培養細胞宿主
a. 挑取含有陽性對照 cDNA 質粒的大腸桿菌單菌落，接入 10 ml 豐富培養基中（如含 1 種選擇性抗生素的 Terrific 肉湯培養基）, 培養基中含有源自空載體轉化大腸桿菌獲得的 10、100、1000、10000 或 100000 個克隆。37°C 振搖過夜培養菌液至飽和。
b. 用商品化試劑盒純化質粒 DNA，純度應達到能夠有效轉染培養的哺乳動物細胞的要求（參見第 1 章方案 9 表 1-6)。
c. 應用第 16 章描述的一種或多種方法將制備的多種質粒樣品轉染培養的真核細胞，檢測陽性對照 cDNA 編碼蛋白的生物活性。
進行 cDNA 文庫篩選時，選用產生最大信噪比而本底低到可接受水平的轉染方法。
如果使用噬菌體 RNA 聚合酶（如 T3、T7 或 SP6) 進行質粒表達載體上的 cDNA 的轉錄并將產物 mRNA 注射到爪蟾卵母細胞
a. 按前述步驟 a 和 b 操作。
b. 利用文庫構建時在 cDNA3'末端引入的稀有酶切位點，對收集并純化的質粒 DNA 線性化處理，然后以之為模板體外轉錄為 mRNA(參見第 9 章方案 6）。
c. 將 mRNA 注射爪蟾卵母細胞，檢測陽性對照 cDNA 編碼蛋白的生物學活性，也可將 mRNA 轉染其他適當的細胞系。
如使用含噬菌體編碼的 RNA 聚合酶啟動子的λ噬菌體載體作為表達載體
a. 制備一系列的噬菌體懸液，其中含有不同比例的空λ噬菌體載體與含有對照 cDNA 的重組λ噬菌體載體（10:1,100:1,1000:1 等等)。用大量噬菌體顆粒感染合適的大腸桿菌株，使細菌菌苔幾乎溶解成片，或使液體培養基中生長的受感染細菌完全裂解（見第 2 章方案 1 或 5)。
b. 從平板上（見第 2 章方案 23) 或從液體培養基中（見第 2 章方案 24) 收集制備λ噬菌體 DNA。
c. 利用文庫構建時在 CDNA3'末端引入的稀有酶切位點，線性化處理λ噬菌體 DNA, 并按第 9 章方案 6 描述的方法將 cDNA 體外轉錄為 mRNA。
d. 將 mRNA 注射到爪蟾卵母細抱，檢測陽性對照 cDNA 編碼蛋白的生物學活性。
2. 以步驟 1 中獲得的結果作為大致的指導，將 cDNA 文庫分成大小適當的篩選亞庫, 用之轉化或轉染大腸桿菌。制備用于目標 cDNA 篩選所需的質粒或λ噬菌體 DNA。
如表達文庫構建在質粒載體上并且文庫在固體培養基生長
a. 從連接反應混合物中（階段 1 步驟 8) 取足夠數目的小份（例如 50~100 份，每份足以產生約 1000 個重組子)，分別獨立電轉化大腸桿菌。將每份電轉化產物全部鋪在 1 個含適當抗生素的 Terrific 瓊脂平板上，37°C 培養過夜。
每個平板上生長的克隆數應達到預期數。例如，篩選的庫容置應達到 50000 克隆，則電轉化所用的連接混合物應足夠產生 50 個每個生長約 1000 個克隆的平板。轉化培養物在鋪平板之前可按步驟 b 在液體培養基培養。
b. 估計每個平板上的克隆數。將每個平板上的克隆刮入 5 ml 豐富培養基中（例如含選擇性抗生素的 Terrific 肉湯培養基)。菌液培養至飽和后純化質粒 DNA 用于篩選。
如表達文庫構建在質粒載體而文庫生長在液體培養基中
這一程序的優點在于省卻了鋪平板步驟，節省了時間與精力。同時，由于在瓊脂平板生長不佳或者機械損傷導致的某些獨立克隆丟失的可能降低了。
a. 從連接反應混合物中（階段 1 步驟 8) 取足夠數目的小份（例如 50~100 份，每份足以產生約 1000 個重組子），分別獨立電轉化大腸桿菌。在每份培養物中重組克隆數應達到預期數目。
b. 電轉化后立即向每份菌液中加入 lml 的不含抗生素的豐富培養基（如 SOC 或 Terrific 肉湯培養基），37°C 在以非常慢的速度振搖培養1h。短暫的培養將使質粒帶有的抗生素抗性基因得到表達，并積累至足以保護轉化細菌的水平。
c. 取部分菌液分別接種 5 ml 培養液。培養至飽和后純化質粒 DNA 用于篩選。
如表達文庫構建在λ噬菌體載體并需篩選 10000 至 100000 個 cDNA 克隆
a. 取適當容量的包裝混合物感染細菌平板制備半致密重組噬菌斑庫。或者，用足夠量的包裝混合物使在液體培養基中生長的大腸桿菌完全裂解。
b. 用平板裂解法或液體培養法分離噬菌體 DNA(見第 2 章方案 23 或 24)。
如表達文庫構建在λ噬菌體載體而需篩選不超過 10000 個 cDNA 克隆
a. 取與需篩選數目相同的重組噬菌體感染細菌平板，密度為每個 100 mm 平板產 1000pfu。
b. 噬菌斑形成后，每個平板加 2~3 ml 的 SM 以制備低滴度的平板裂解液，計算其滴度。
c. 用低滴度的平板裂解液感染液體細菌培養物，制備高滴度的噬菌體貯存液。
d. 用液體培養法純化噬菌體 DNA(見第 2 章方案 24)。
3. 將純化的克隆轉移到適當的背景體系中以分析其表達
如克隆為純化的質粒 DNA: 將質粒 DNA 轉染培養的哺乳動物細胞，或以其為體外轉錄模板，用噬菌體 RNA 聚合酶制備 mKNA 并注射到爪蟾卵母細胞中。
如克隆為純化的λ噬菌體 DNA: 線性化處理λ噬菌體 DNA, 以其為體外轉錄模板合成 mRNA 并注射到爪蟾卵母細胞中。
一個典型的轉染實驗使用 50~100 個平皿的培養細胞，可獲 50000^100000 個 cDNA 克隆（每個平血含 1000 個獨立克隆)，以篩選是否表達目的生物活性。而一個典型亞庫的 mRNA 注射 5 個爪蟾卵母細胞，每個亞庫含 1000 個獨立克隆，則需 250~500 個卵母細胞用于 50000~100000 個 cDNA 的生物活性篩選。
4. 檢測目標 cDNA 編碼蛋白的生物學活性。
5. 鑒定出陽性亞庫后不斷將其分成越來越小的庫，重復檢測直至分離鑒定得到目的 cDNA 單克隆。實現這一目標的最簡單方法是使用來自陽性亞庫的重組質粒或λ噬菌體 DNA 純化產物，步驟如下：
a. 將陽性（初級）亞庫質粒或噬菌體 DNA 分為小份，每份中可產生的重組轉化克隆或噬菌斑數約為初級亞庫的十分之一。
1 個含 10000 個獨立克隆的初級亞庫需分為約 30 份，每份可產生約 1000 個克隆或噬菌斑。
b. 重復上述步驟 3 和 4。在重復篩選時應將初篩陽性亞庫引入作為陽性對照。
c. 重復分選步驟直至得到表達靶標生物活性的單個重組子。必須確保用于最終篩選的噬菌體或質粒 DNA 只來源自單個噬菌斑或菌體克隆。
6. 利用 DNA 測序（第 12 章)，表達（第 15 或 16 章）和 RNA 雜交（第 7 章）的方法鑒定挑取的編碼靶標生物活性的 cDNA 單克隆。
如果重組子不包含 cDNA 的全部編碼區，則可用初次挑選的 cDNA 作為探針，利用高嚴謹度雜交從 cDNA 文庫中篩選更多的重組子。 |
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