質譜沙龍第三十一期活動報道

　　2011年5月29日，第三十一期質譜沙龍活動在第二炮兵總醫院藥學部成功舉行。來自第二炮兵總醫院、北京大學醫學部、北京師范大學、北京艾米諾醫學研究有限公司等近二十余位專家、學者、技術工程師等參加了本次沙龍活動，共同探討了質譜技術在生物醫藥方面的前沿應用。

質譜沙龍活動現場

氨基葡萄糖檢測方法小結及有關問題討論

　　二炮總醫院李鵬飛老師為大家帶來了題為《氨基葡萄糖檢測方法小結及有關問題討論》的報告，簡單介紹了氨基葡萄糖及其在人體中的作用，在總結5篇參考文獻后，李老師給出了自己的分析檢測方法，并探討了在分析實驗中遇到的各種問題及電噴霧離子化的影響因素。

二炮總醫院 李鵬飛 老師

　　氨基葡萄糖是存在于基體內尤其是關節軟骨中的氨基單糖，是人體關節合成蛋白聚糖所必須的重要成分。基體吸收氨基葡萄糖后，進入關節組織包括關節軟骨，隨后經軟骨細胞作用生成葡萄糖胺聚糖鏈的組分并刺激生理性蛋白多糖的合成。本品有直接抗炎作用，可緩解關節的疼痛癥狀，改善關節功能，并可組織骨關節炎病程的進展。臨床適應癥為原發性或繼發性骨關節炎。

　　文獻總結

　　李老師對5篇使用液質做的參考文獻加以比較，具體情況見下表。

	文獻1	文獻2	文獻3	文獻4	文獻5
色譜柱	-CN	-CN	-CN	-NH2	-NH2
前處理方法	沉淀-吹干-復溶	沉淀-吹干-復溶	沉淀-吹干-復溶	沉淀-過濾膜	沉淀
流動相	乙腈-2mM乙酸銨	乙腈-2mM乙酸銨	乙腈-2mM乙酸銨	乙腈-水	乙腈-少量醋酸
內標及保留時間	米格列醇	米格列醇 2.8/2.8	valibose	法莫替丁6.84/4.07 5.85（干擾）	羅沙替丁 6.6/3.6
定量離子對	180/72	180/72	180/72		180/162

　　下面，李老師詳細介紹了文獻中樣本前處理。取100mL血樣，加入50μL內標、50μL甲醇和200μL乙腈，渦流1min，11000rpm沉淀5min，除去蛋白，然后取出200μL上清液轉移至玻璃試管，在40℃下用氮氣吹干，用50:50:2.5的200μL乙腈/水/乙酸復溶，最后取20μL進LC-MS/MS分析。按照次方法，李老師推測回收率至多是50%。

　　接下來，李老師又講解了基質效應、質譜條件和色譜條件，及其內標的選擇。該內源性物質對離子化產生的抑制或增強作用比較大。由于它是高極性、堿性化合物，所以質譜條件選擇ESI/[M+H]+正離子模式。氨基葡萄糖是高極性化合物，故很難用有機溶劑把它從血漿中萃取出來，蛋白沉淀是血漿制備的唯一方法，應用LC/ESI-MS/MS時可能會導致離子抑制。因此，血漿中氨基葡萄糖的準確定量需要合適的色譜柱和流動相。文獻中是使用氨基柱和氰基柱，李老師在探索能否使用C8和C18柱子，而且對其進行衍生化。流動相最終確定為：乙腈/水/乙酸（50:50:2.5），保留時間為3.7min，色譜峰窄，分析時間為4.2min/樣本。選擇合適的內標對LC/MS/MS是較為重要的，穩定同位素標記的類似物作內標是被高度推薦的，因為基質效應不會影響被測物和內標離子化的相對效率，在該文獻的實驗中，Valibose在結構上類似氨基葡萄糖，被采用作為內標，和被測物幾乎有一致的保留時間。

　　李老師的方法

　　李老師在參閱一些文獻后，總結出了自己的分析方法。向1.5mL EP管中加入血漿樣本150μL，加入內標沉淀劑150μL，渦流30s，13200r/min離心5min。將上清液移至2.0mLEP管中，加入1mL二氯甲烷，渦流30s，震蕩10min，（6次/min），13200r/min離心5min，取150mL上清液進行LC-MS/MS分析，進樣量15μL。

　　色譜柱是Agilent TC-18柱，5mm粒徑，150×4.6mm I.D.；流動相使用乙腈-0.01%氨水溶液梯度洗脫；流速控制在1.0mL/min，柱溫20℃，進樣量15μL；內標采用1.0μg/mL氨芐西林（5%磺基水楊酸水溶液）。李老師根據該方法和條件，對空白血、空白溶劑、空白血和標準化合物、實際樣品等四種情況進行了分析。

　　問題與討論

　　在氨基葡萄糖分析檢測過程中，李老師遇到了一系列問題，并給出了他的思考看法和解決方案。1）氨基葡萄糖在體內存在，為什么空白血漿中檢測不到？這是個有爭議的問題，有的文獻說有這種內源性物質，而有的說沒有；在色譜圖中有的可以看到，而有些看不到。2）樣本前處理過程中，200μL上清液吹干后200μL復溶，有什么意義？200μL復溶能消除溶劑效應。3）內標選擇原則？選擇跟氨基葡萄糖性質相近的內標物質很困難，同位素內標是不行的，李老師嘗試了氨芐西林、氯唑西林等多種物質。4）標準曲線范圍的確定？達峰濃度的一倍以上作為高線，達峰濃度的1/5～1/20選擇一點作為低線比較合適。5）離子抑制問題？前沿峰？死時間？選用C18柱檢驗這些參數。前沿峰是離子抑制最嚴重的問題，想辦法怎樣將前沿峰、死時間分開，對氨基葡萄糖抑制怎樣排除掉。6）色譜柱分類？選用C18柱做。7）離子化方式？離子化是ESI源。

　　電噴霧離子化的影響因素

　　電噴霧離子化-質譜法（ESI-MS）作為一種軟電離質譜技術，具有專業性強、靈敏度高等特點；液相色譜-電噴霧離子化-質譜法（LC-ESI-MS）作為分離和分析相結合的技術，特別適合分析極強性、難揮發或熱不穩定的化合物，目前已成為分析復雜生物體系中痕量生物活性物質的強有力手段。電噴霧離子化過程有EI和TIS兩種方式，EI是從進樣口進來的樣品液體被霧化氣吹成霧滴，加上噴嘴上的高壓電使霧滴帶電，帶電霧滴法去溶劑后生成樣品離子；TIS工作原理同EI，不同的是TIS有輔助加熱器（GS2），可加大去溶劑的速度，可用于比較大的液體流量。

　　質譜離子檢測器收集到分析物離子的數量多則響應值高，反之則低。ESI中決定響應值的因素由分析物的性質和儀器因素組成，分析物的帶電能力是關鍵因素，儀器因素主要影響了分析方法的重現性。研究顯示儀器因素對不同分析物的影響不同，儀器參數不僅對響應值有影響，LC-ESI-MS的噴霧電壓、毛細管電壓、毛細管溫度和透鏡電壓等參數之間也有相互影響。影響分析物離子數量的因素還有溶劑的性質、組成和干擾物質的影響，添加劑、離子對試劑的影響，基質效應的影響，以及溶液的流速。

　　最后，李老師總結說，ESI過程復雜，很多因素影響分析物最終的響應值。隨著對其噴霧和電離過程研究的細化和深入，其影響因素將不斷得到更全面、準確的認識。當各種因素影響LC-ESI-MS響應值的機制得到清晰闡述后，就可在體內藥物分析過程中充分利用其特性，降低機制效應，排除干擾，獲得更高的分析靈敏度和更好的分析方法重現性。

 

LC-MS分析方法在放射性藥物研究中的應用

　　北京師范大學化學學院的喬晉萍老師作了題為《LC-MS分析方法在放射性藥物研究中的應用》的報告，介紹了LC-MS對放射性藥物的分析及其在小鼠實驗方面的應用。

北京師范大學化學學院 喬晉萍 老師

　　放射性藥物（radiopharmaceuticals）就是在藥物結構中引入放射性核素，根據核素放射不同種類的射線而達到對疾病的治療和診斷目的。作為一種非侵入性的診斷顯像劑，放射性藥物可以提供病變組織或器官的功能和結構信息，是核醫學發展的基礎和支柱。根據放射性核素發出的射線不同，放射性藥物分為單光子放射性藥物（SPECT藥物）和正電子放射性藥物（PET藥物）。常見SPECT藥物的標記核素是Tc-99m、I-131、Ga-67、Tl-201；PET藥物的標記核素有C-11、F-18、O-15、N-13。喬老師所在實驗室目前使用Tc-99m和I-131。

　　LC-MS方法引入到放射性藥物研究中，主要進行藥物的質量控制和藥物的代謝研究。臨床使用SPECT藥物時都是在核藥房標記后，直接用于患者，因此放射性藥物質量控制尤為重要，喬老師所在實驗室就承擔了此項的工作任務。喬老師通過UPLC-MS方法研究溶液中雙半胱乙酯（ECD）的氧化動力學和經典恒溫法研究雙半胱氨酸（EC）穩定性和保質期兩個實例詳細講解了使用LC-MS方法研究SPECT藥物的一些研究進展。SPECT藥物因為儀器檢測分辨率低，在臨床診斷疾病效果不明顯，所以目前PET顯像是核醫學研究的主流。

　　PET藥物在標記過程會使用有毒催化劑和有害化學溶劑，且標記過程中會產生多種反應副產物，因此，臨床使用前必須進行化學雜質檢測。美國對此已經開始比較系統的研究，而我國2005版中國藥典尚未收錄正電子藥物。喬老師指出一個成功的PET藥物，必須具備高靶向分布、高親和力、代謝穩定性好、藥代動力學性質優良等性質。根據放射性藥物的特點，喬老師建立了一個Radio-LC-MS的方法，把放射性的檢測器和液質儀器聯接起來，根據不同測試需要可以采用串聯模式或并聯模式。隨后喬老師以帕金森疾病診斷的顯像劑F-18標記的AV133為例講述了Radio-LC-MS方法取得的實驗結果。不斷試驗過程中，喬老師發現實驗對小鼠的使用量很大，而且小鼠個體之間差異很大，這就造成試驗數據的可靠性減低，為此喬老師引入了微透析的技術，得到的實驗結果表明該技術的引入對實驗幫助很大。但由于微透析和放射性檢測仍存在一些差異，因此兩者的匹配性研究還是今后需要解決的問題。

 

QTRAP實戰指南之三——ER的應用

　　AB SCIEX公司質譜部應用技術支持李立軍經理作了題為《QTRAP實戰指南之三----ER的應用》，介紹了高分辨ER掃描方式及其應用。

AB SCIEX公司質譜部應用技術支持李立軍經理

　　QTRAP儀器上有一個增強分辨率的掃描方式——ER掃描，這種掃描方式可以獲得感興趣離子的高分辨MS。第一個質量掃描四極桿（Q1）設定質量窗口為感興趣離子的左右6～8amu。離子被貯存在離子肼中，在一個較窄的質量范圍（～20amu）內以低掃描速度（250amu/sec）掃描輸出，這種掃描方式可以得到～0.15amuFWHM峰寬。

　　離子阱的ER不同于5600等TOF的高分辨率，QTRAP的ER得到的不是精確質量數，所以結果中并不能給出元素組成，主要用于觀察電荷狀態，確定帶幾個電荷或者用于區分兩種混合物。對于IDA，可據此確定需要做EPI的母離子，相對準確度質量數。

　　下面，李經理給大家講解了ER在分析中的應用。1）某未知物，確定分子量。通過ER，看出245為雙電荷峰，從而確定MW=488；另外，MS2（或EPI）也證明了245不是M+H。2）甘油三酯類掃描。用Q1掃描出現很多重合疊加的峰，分離很不明顯，而ER能將每個峰都分離的很清晰。3）經過LC分離后的MS2，沒有了425、369等碎片離子，進一步說明未分離時425、369等是由906.8（PPG類雜質）產生的。4）當定性分析初篩時或中性丟失時，因為得到的母離子往往分辨不足，容易產生誤判，下一步EPI很可能會出錯，這時也需要增加ER掃描，準確確定母離子。5）3200Q分析苯乙醇甘類代謝物。掃描速度選擇250Da/s，李經理對PREC得到的質譜圖和ER得到的質譜圖進行了比較。6）對于生物大分子多肽的分析。最后，李經理簡要總結了ER增強分辨率等優點。