質譜沙龍第十三期活動報道

發布時間：2008-11-06 17:08 原文鏈接：質譜沙龍第十三期活動報道

2008年10月26日下午，質譜沙龍第十三期活動在中國食品發酵研究院會議室舉行。會議有來自二炮總醫院、朝陽醫院、北大醫學院、北醫三院、空軍總醫院、中科院植物所、中科院過程工程所、AB公司等老朋友，還有來自島津公司、摩爾美康實驗室、安貞醫院等新朋友。

首先由發酵研究院的林峰介紹發酵院的一些基本情況。發酵研究院是國資委下中輕集團下屬的央企，前身隸屬于輕工業部。發酵研究院主要的部門有：食品工程研究發展部、發酵工程研究部、釀酒工程技術研究發展部、標準和信息技術研究發展部、食品質量檢測部五個事業部。林峰所在的蔡木易副院長的課題組屬于發酵事業部，主要從事食源性肽的工業化開發，具體來說是利用一些天然的蛋白原料，比如大豆蛋白、玉米蛋白、海洋魚皮膠原蛋白、魚肉蛋白，變廢為寶，做成一些可以食用的、具有特殊功能的肽，也利用質譜的方法對肽進行深入研究。

人體內45種氨基酸定量檢測和腸內外營養

然后由二炮總醫院的李鵬飛老師做題為《人體內45種氨基酸定量檢測和腸內外營養》的報告，這是跟AB公司合作開發的方法，李老師談了一些方法開發的體會。首先，李老師介紹了開發氨基酸定量檢測方法的意義，尤其是臨床方面的意義。在結果分析方面，主要介紹了氨基酸和相關疾病尤其是代謝類疾病之間的關系，比如腎臟類疾病，肝性腦病、神經系統疾病，以及氨基酸和靜脈營養方面的關系等；單獨就一種氨基酸如牛磺酸來說，它也具有很多臨床意義。然后，介紹了以前的一些氨基酸測定方法及其原理，比如：氨基酸分析儀、HPLC帶柱前衍生、HPLC配合其它的方法。但這些方法的問題是：無法區分某些氨基酸，如Asn/Glu-Gln，Thr/Ser，Gly/Ala，Iie/Leu，柱后衍生的溫度比較高，檢測時間較長。在新生兒篩查中，可通過測定十幾種氨基酸對新生兒進行評價。還有一種CIL的同位素內標記物來檢測。

李鵬飛老師

iTRAQ試劑標記流程

李老師在AB公司儀器和試劑的基礎上，開發了新型的檢測方法。即利用iTRAQ試劑和45種氨基酸混合物的標準品，25分鐘內測定樣本中的45種氨基酸。在實驗中，李老師也探索了一些條件，比如用十二烷基磺酸鈉沉淀蛋白；采用正亮氨酸做內標校正系統誤差；不能用全血，而是抽完全血半小時后離心，先分離出血漿，再沉淀蛋白；上清液轉移到緩沖溶液用115試劑標記，最后吹干后把114標記的標準品加入，再進行LC-MS/MS檢測；在LC-MS/MS檢測時的技巧是分段掃描。這種方法的特點是：同時檢測氨基酸種類更多（45種）；方法更為快速、簡便（25分鐘）；準確度更高（同位素內標）。另外，對于亮氨酸、異亮氨酸、別亮氨酸、正亮氨酸還有特殊的方法。如果裝上“可立快”軟件，方法開發會更容易。

詳細原理可見：質譜沙龍第七期活動報道中 “準確的定量和快速篩查方法：用LC/MS/MS做臨床氨基酸測定”

李老師介紹的第二部分的內容是：腸內外營養的一些知識，可以幫助大家更好地了解營養科學和營養治療的一些常識。

報告下載：

人體內45種氨基酸定量檢測和腸內外營養
營養治療藥師

AB質譜日常應用的保養和維護

接下來，由AB公司的資深技術工程師劉謙為大家介紹了AB公司質譜日常應用的保養和維護知識。

劉謙工程師

首先介紹：API series、Qtrap、Qstar液質聯用儀的維護計劃，分為每天、每周、三個月的維護計劃及其具體操作步驟，用列表表示，一目了然。同時，也介紹了MALDI源的質譜Voyager、4700、4800 MALDI-TOF型儀器的維護計劃。劉工用圖示的方法，具體介紹了：機械泵維護步驟、無信號診斷步驟、軟件判斷無信號故障、靈敏度低檢查步驟、重復性差檢查步驟、處理Analyst通信不上的9個步驟、處理4000 Series Explorer通信不上的4個步驟、如何延長分子泵的壽命、離子源噴口與orifice的位置的影響、常用部件號、常用試劑列表、常用工具列表、API儀器主要電路模塊圖。對于用戶來說，這種系統的總結非常簡潔、扼要，是關于快速維護儀器的極有幫助的報告。

報告下載：AB質譜日常應用的保養和維護

離子阱飛行時間質譜在小分子領域的應用

應用工程師萬樂人

接著，由島津公司生命科學部的應用工程師萬樂人介紹了島津的IT-TOF液質聯用儀器的結構、特點、應用。下面是介紹的摘要：

設計IT-TOF的背景是：很多人很喜歡離子阱，它可以做多級質譜。但離子阱最大的問題是慢（duty cycle時間長），在很多情況下適應不了快速液相的要求，質量精度也比較差，島津在離子阱后面加了TOF，就是要解決精度的問題，據萬工介紹，某些用戶反映，使用IT-TOF外標法可以做到2ppm的精度。

結構及其特點：

1）IT-TOF的離子源是正交離子源，在離子聚焦系統中，具有ZL的八極桿技術，它的八極桿不是勻質的，末端的黑色部分涂了電阻材料，形成電位梯度，與其鄰近電極的電壓配合，將ESI連續離子流轉變為脈沖離子流，進入離子阱。離子在八極桿聚集（accumulation）的時間是可以控制的，如果樣品濃度很高，可以縮短聚集時間，如果濃度很低，可以增加聚集時間。

2）把TOF的檢測和離子源完全分離開（decouple），即離子源和后面的檢測沒有關系。在離子從離子阱IT到TOF時，離子總是從離子阱的中心發射出去，不管用任何源，一次校正后，就可以一個月長期達到5ppm的質量精度。

3）這里，離子阱的工作原理是：用射頻電場控制離子，環電極上的射頻電場是零電位的，使離子可以很有效地進入，在入口端電極加上幾十伏的電壓，離子可以迅速進入離子阱，當離子進入以后，按照嚴格的時間程序，施加射頻電場，離子在阱中高頻振動，同時通入惰性氣體冷卻離子，離子聚焦在阱的中心，等待發射到TOF里。

IT-TOF的設計難點是：IT的離子如何發射到TOF？TOF是脈沖型檢測器，進入到TOF的離子要有很高的動能，才能在TOF里飛行。島津的兩項設計比較獨特，一個是彈道離子提取技術，一個是高頻高壓的開關。

彈道離子提取技術是島津的ZL，在離子拋出時，入端蓋極和出端蓋極成為兩個直流的高電壓板，入端蓋極和出端蓋極加上5萬伏的高壓，正離子加7KV，負離子加－7KV，然后可以高速拋出離子。

在直流拋出時，射頻電場是一個妨礙作用。這時射頻電場要迅速關閉，這就需要高頻高壓瞬時開關。大家知道，TOF做正負極切換是很危險的，很容易造成儀器的損壞。島津因為采用高頻高壓瞬時開關技術，可以很方便實現快速正負離子切換。當然，它更重要地是解決了離子從阱中高速拋到TOF的問題。

另外，島津還正在研發數字離子阱，也是利用高頻高壓瞬時開關技術。傳統的射頻離子阱射頻是一個正弦波，馬修方程是非常復雜的；如果做成一個方波，方波是很容易被控制的。但是要實現快速電壓變化的話，也需要高頻高壓瞬時開關。

在介紹應用方面，主要介紹了多級質譜配合精確質量測定的應用。例子顯示了在做任何一級質譜時，都可以做到很高的質量精度，5級、6級質譜都能做到5ppm。同時，IT-TOF價格有優勢，比如有類似功能的Orbitrap（賽默飛世爾科技生產）的錢可以買兩臺IT-TOF。

在藥物雜質分析應用方面，專門舉了一個例子，是國內某標準研究部門做咖啡因的藥物雜質分析。藥物雜質分析是很困難的，過去很多藥廠只能把每個雜質都純化出來后做核磁共振。舉例顯示了用IT-TOF的快速、準確的鑒定方法。比如其中有一個三號雜質m/z 223鑒定很困難。首先，咖啡因的三級質譜碎裂模式是：195－138－111的碎裂。而雜質的碎裂方式為：223－166－139和149；四級質譜為：139－122和85；149－121和93。這些碎片再通過高質量精度質譜推斷。233到166存在67的丟失，經判斷為C₂H₃ON的丟失；166－149、139－122都是17的中性丟失，判斷為NH₃。這時用軟件計算候選化合物元素組成，得到兩個結果，其中只有第一個結果含N，C₉H₁₀N₄O₃，其中，四級質譜實測值93.0447，理論值93.0454，精度為-7ppm。再根據這個元素組成的結果，推斷出可能的結構式，與各種檢索方式相結合，獲得最終比較可靠的結果。

最近大連化物所許國旺教授課題組發了一篇文章，并作為Analyst 9月份的封面，是關于代謝組學方面的工作。其中，液質是用IT-TOF來作的。這篇文章的主要貢獻為：研究了一個典型的病例：強制性脊柱炎；因為代謝組研究的很多是小分子，所以該研究用了氣質聯用液質聯用兩種儀器，得到了比較全面的結果；血樣和正常人的血樣做對比，做了主成分分析，找到一些有意義的biomarker。

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