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  • 發布時間:2018-07-17 14:01 原文鏈接: 做細胞計數實驗如何計數?

    實驗用品:0.4% 臺盼藍溶液、無水乙醇或 95% 乙醇溶液、脫脂棉、普通顯微鏡、試管、吸管、毛細吸管、細胞計數板、綢布。

    實驗原理:在細胞培養工作中,常需要了解細胞生活狀態和鑒別細胞死活,確定細胞接種濃度和數量以及了解細胞存活率和增殖度,如用酶消化制備的細胞懸液中細胞活力的鑒別,凍存細胞復蘇后的活力檢測等。細胞懸液制備后,常用活體染料臺盼藍對細胞進行染色,進行細胞計數。臺盼藍不能透過活細胞正常完整的細胞膜,故活細胞不著色。而死亡細胞的細胞膜通透性增高,可使染料進入細胞內而使細胞著色(藍色)。

    細胞計數一般用血細胞計數板,按白細胞計數方法進行計數,便于確定細胞的生活狀況。

    實驗內容與方法:(一)制備動物細胞懸液:將動物細胞用生物鹽水制備成適當濃度的細胞懸液備用。

    (二)細胞計數:計數板處理用無水乙醇或 95% 乙醇溶液擦拭計數板后,用綢布擦凈,另擦凈蓋玻片一張,把蓋片覆在計數板上面。

    1. 染色:用滴管吸取 0.4% 臺盼藍染液,按 1∶1 比例加入細胞懸液中。從計數板邊緣緩緩滴入,使之充滿計數板和蓋片之間的空隙中。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中或帶有氣泡,否則要重做。稍候片刻,將計數板放在低倍鏡下(10×10 倍)觀察計數。

      計數方法:按圖計算計數板的四角大方格(每個大方格又分 16 個小方格)內的細胞數。計數時,只計數完整的細胞,若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數。在一個大方格中,如果有細胞位于線上,一般計下線細胞不計上線細胞,計左線細胞不計右線細胞。二次重復計數誤差不應超過 ±5%(圖 7-1)。鏡下觀察,凡折光性強而不著色者為活細胞,染上藍色者為死細胞。

    1. 計數的換算:計完數后,需換算出每 ml 懸液中的細胞數。由于計數板中每一方格的面積為 0.01 cm2,高為 0.01 cm,這樣它的體積為 0.0001 cm3,即 0.1 mm3。由于 1 ml=1 000 mm3,所以每一大方格內細胞數×10 000=細胞數/ml,故可按下式計算:

      細胞懸液細胞數/mL =4 個大格細胞總數/4×10 000。

      如計數前已稀釋,可再乘稀釋倍數。

      計數細胞后,計算細胞懸液濃度并求出存活與死亡細胞數的比例。

      注意事項:向計數板中滴細胞懸液時要干凈利落,加量要適當,過多易使蓋片漂移,或淹過蓋片則失敗,需重做,過少易出現氣泡。不理想時,應重做。

    鏡下計數時,若方格中細胞分布明顯不均,說明細胞懸液混合不均勻,需重新將細胞懸液進行混合,再重新計數。


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