1.7 抗體純化
1.7.1 多克隆抗體的純化采用辛酸-飽和硫酸銨法純化抗β-內酰胺酶的兔血清，2次滴加飽和硫酸銨的最終體積分數分別為50%和40%。將沉淀用少量PBS溶解后轉入透析袋中，用PBS溶液透析48h，利用紫外分析法檢測透析液直至透析完全。
1.7.2 單克隆抗體的純化采用PEG6000沉淀法純化Balb/C小鼠的腹水，沉淀用50mmol/LTris-HCL溶液（pH8.0）溶解，冰浴除雜蛋白，即得粗提單克隆抗體，用SDS-PAGE對抗體純度進行鑒定。
2 結果與分析
2.1 免疫原
通過SDS-PAGE分析β-內酰胺酶和青霉素酶，兩種蛋白的分子質量及純度見圖1。兩種蛋白在分子質量為30ku處均有明顯的蛋白表達，分子質量數據與預期相符。β-內酰胺酶經SDS-PAGE分析，純度達100%，與說明書一致。青霉素酶經Bandscan軟件分析，純度達61.4%，含有大量雜蛋白。使用純度較好的β-內酰胺酶作為免疫原。
2.2 兔抗β-內酰胺酶多克隆抗體效價
4免后，3只日本大耳兔的效價分別為1×106，2×106，1×106（見圖2）。其中2號大耳兔的效價最高，選取2號大耳兔的血清做ELISA的優化實驗。
2.3 ELISA篩選方法
2.3.1 包被原濃度采用方陣法，用系列濃度稀釋的青霉素酶橫向包被96孔酶標板，將倍比稀釋的一抗縱向加入（用"+"表示），每組加入50μg/mL的青霉素酶做抑制試驗（用"-"表示），使用間接ELISA法確定最佳抗原包被濃度。當包被原質量濃度為5μg/mL，兔血清質量濃度為1∶64000時，OD450 接近1，且抑制效果最好。使用5μg/mL青霉素酶作為包被原。
2.3.2 包被條件選擇4℃overnight，37℃1h，37℃ 2h 3種方式包被，以確定最佳包被條件。根據P/N的比值，確定4℃overnight為最佳包被濃度。
2.3.3 青霉素酶結構復雜，含雜蛋白。7種封閉液中，使用3%BSA+0.05%吐溫+3%蔗糖封閉，特異性最好，封閉效果最佳。
2.3.4 封閉時間采用間接ELISA確定最佳封閉時間。當封閉時間2h時，陰性值較低，P/N比值為最大，封閉效果最佳。
2.4單克隆抗體的制備
2.4.1 BALB/C小鼠免疫效果從免疫結果看，低劑量組（50μg/只）Balb/C小鼠產生抗體的效價最高，達1:128000。同時比較Balb/C小鼠的精神狀態，低劑量組較中、高劑量組的Balb/C小鼠體態活躍，被毛光亮。使用低劑量組的Balb/C小鼠脾臟進行融合。
2.4.2 細胞篩選及亞克隆細胞融合后， 融合率為80%，陽性率為20.5%。經4 次亞克隆，陽性率為100%，篩選出能穩定分泌抗β-內酰胺酶抗體的3株陽性細胞株，分別命名為C1，D1，F8。將F8連續傳代3 周及凍存復蘇后，檢測ELISA 效價，結果基本不變，說明所獲雜交瘤細胞株穩定。
2.5 抗體特性分析
2.5.1小鼠腹水中單抗效價及親和力測定結果用間接ELISA法檢測3株雜交瘤細胞無血清培養基上清效價（1∶32）～（1∶512）。將3株雜交瘤細胞均腹腔注射獲取腹水，3株雜交瘤細胞株中F8腹水的效價最高，選擇F8做后續實驗。采用非競爭酶免疫試驗進行測定。經親和力常數公式計算，F8的親和力為6.4×107L/mol。
2.5.2 3株雜交瘤細胞亞型的鑒定結果使用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒，對篩選出的3株單抗C1，D1，F8進行亞型鑒定，這3株雜交瘤細胞均屬于IgM 亞型。
2.5.3 F8雜交瘤細胞株染色體的分析 計數100體數目總和基本一致（已知SP2/0細胞染色體數個處于有絲分裂中期的完整F8細胞，染色體數目62～68條，Balb/C小鼠脾細胞的染色體數目為96～104條（圖7），與SP2/0細胞和脾細胞的染色40條）。
2.5.4 Western-Blotting檢測F8的特異性Westernbloting鑒定表明，F8 腹水可與β-內酰胺酶和青霉素酶發生特異性反應（圖8），說明F8是針對β-內酰胺酶和青霉素酶的特異性抗體。
2.6 F8雜交瘤細胞株單克隆抗體的純化
比較了辛酸-冷酒精法、辛酸-飽和硫酸銨法、PEG60003種方法，經PEG6000方法純化的單克隆抗體雖然純度不高，但抗體效價保存最好。
3討論
金屬β-內酰胺酶是一類活性依賴二價金屬陽離子的β-內酰胺酶，該酶廣泛水解（包括碳青霉烯類、廣譜頭孢菌素類等）多種β-內酰胺類抗生素，對常用 β-內酰胺酶抑制劑（如克拉維酸、舒巴坦等）不敏感。依據分子生物學，Bush于1997年將當時有序列資料的12種金屬酶分成3個亞群：B1，B2，B3。絕大多數金屬酶屬于B1亞群，該亞群的各種酶分子質量相近（約為28ku），序列一致性大于23%。B2亞群與B1亞群的分子大小相近，但同源性較低。B3亞群只有9個氨基酸與其它金屬酶顯著不同，單體分子質量為31.7ku。雖然各亞群金屬酶之間的氨基酸序列同源性不高，但是酶蛋白形成的立體結構卻很類似，金屬酶中的關鍵殘基，尤其是形成金屬鍵的氨基酸殘基高度保守。鑒于β-內酰胺酶的結構特點，選擇純度較好的β-內酰胺酶作為免疫原。為了使篩選的單克隆抗體能更好地識別β-內酰胺酶，使用中檢所的青霉素酶作為包被原。目前，市售β-內酰胺酶檢測膠體金試紙條多數采用的是間接法。間接法是利用β-內酰胺酶酶解青霉素的原理，將牛奶樣品與微量青霉素混勻反應。如果牛奶中存在一定濃度的β-內酰胺酶，那么青霉素經β-內酰胺酶酶解后濃度減少。用試紙條檢測青霉素，判斷牛奶中是否存在β-內酰胺酶，但是待測樣品要經過多次離心、孵育等工序處理后方可使用試紙條進行檢測。而本研究通過研制抗β-內酰胺酶的單克隆抗體和多克隆抗體，使用雙抗夾心法，膠體金試紙條直接檢測。該方法的優勢是減少反應時間，優化反應步驟。
另外，細菌耐藥也能產生內源性β-內酰胺。牛奶中內源性β-內酰胺酶的來源主要有2種途徑：一是牛體本身產生的，二是牛本身感染的某些有抗性的微生物在體內不斷分泌表達β-內酰胺酶。目前尚未有能區分產品中所含β-內酰胺酶是人為添加還是耐藥細菌產生的報道，這是監管β-內酰胺酶的一個新難題。只有加強畜牧業、奶業生產全過程管理，提高養殖人員的安全責任心，才是消除抗生素殘留，保障牛奶和奶制品安全的根本。