《科學·進展》：中國科學家發現膽固醇竟是PDL1的“穩定器”

PD-L1具有一種獨特的配置來保證其穩定性。依賴于兩個關鍵的CRAC膽固醇基序，PD-L1與膽固醇結合，防止自身被降解。當這兩個基序發生突變時，即會破壞PD-L1與膽固醇的結合作用

對于人體來說，膽固醇究竟是友是敵？

一方面，膽固醇是細胞膜的主要成分，與細胞膜的結構完整性、厚度、滲透性和流動性有關，并可以通過影響多種跨膜蛋白（如Na+-K+泵）的結構、功能和動力學來調節細胞功能。同時，膽固醇還是多種激素的前體，在調節細胞功能和信號傳導的過程中起關鍵作用[1,2]。

另一方面，過多的膽固醇長期堆積在動脈中會形成斑塊，一旦斑塊破裂便會阻塞血液流向心臟和大腦，引發心血管疾病[1]。近年來還有越來越多的研究表示，膽固醇在癌癥進展中也發揮著重要作用，癌細胞的快速增殖和侵襲需要高水平的膽固醇，且腫瘤微環境中的高膽固醇水平會影響腫瘤浸潤免疫細胞的表型和活性。如果使用他汀類藥物降低膽固醇水平，可在多種類型癌癥中獲益[2]。因此，調節膽固醇水平被認為是抗癌和提高免疫治療效果的“潛力股”。

如此來看，膽固醇與人體細胞之間的平衡著實是十分微妙。

中國科學院的歐陽波、溫茂榮與天津醫科大學的王樹清等人合作，揭示膽固醇在調節細胞表面PD-L1水平的過程中具有獨特作用，為癌癥治療藥物的開發提供了新見解。

他們發現，膽固醇可以與PD-L1跨膜結構域上的兩個CRAC基序識別并結合，形成“三明治”結構，從而增加PD-L1的穩定性，防止其降解，可能有助于腫瘤細胞逃避免疫監視。研究于近日發表在Science Advances期刊上[2]。

論文首頁截圖

PD-L1就不用多加介紹了，免疫治療中的明星靶點，在腫瘤細胞表面高表達。當PD-L1與免疫細胞表面的PD-1識別互作后，則會讓免疫細胞對腫瘤細胞“視而不見”，抑制免疫應答反應。PD-L1免疫抑制劑便是通過特異性阻斷PD-1/PD-L1的相互作用，來恢復 T 細胞的腫瘤殺傷活性。

PD-L1身上，還有哪些寶藏有待發掘和利用呢？

有研究表明，使用他汀類藥物治療時，細胞表面的PD-L1水平顯著降低，說明PD-L1與膽固醇之間可能存在密切關系。另外，已經發現PD-L1的跨膜結構域含有兩個經典的CRAC膽固醇結合基序，這樣一來，膽固醇直接作用于PD-L1的嫌疑就更大了。不過，膽固醇究竟對PD-L1的穩定性和功能有啥影響，尚未有定論。

在這項研究中，歐陽波等人首先在人結直腸癌細胞系（RKO）中進行免疫熒光染色和共定位分析，發現PD-L1和膽固醇之間具有很強的空間相關性。

隨后，研究者們分別用膽固醇、甲基-β-環糊精（MCD）、辛伐他汀處理RKO細胞。其中，MCD和辛伐他汀都有降低膽固醇的效果。

蛋白質印跡分析、共聚焦成像等結果顯示，向RKO細胞中添加膽固醇會增加質膜中膽固醇的含量，PD-L1水平顯著上調；而添加 MCD 或辛伐他汀的效果則與之相反，膽固醇被去除后，細胞表面的PD-L1水平顯著下調，且內源性PD-L1的泛素化修飾增加，可能與其被泛素化降解有關。

對于PD-L1來說，膽固醇似乎有特別之處 

研究者們在人永生化骨髓性白血病細胞系（K562）進一步驗證上述結論。這次，他們在K562細胞中加入干擾素-γ（IFN-γ）來刺激其表達PD-L1，導致K562細胞的PD-L1水平上調。結果發現，在這種情況下使用MCD或辛伐他汀來降低膽固醇水平，K562細胞的PD-L1水平依舊顯著下調。

這些體外實驗表明，在細胞維持PD-L1水平的過程中，膽固醇扮演了至關重要的角色。

利用多功能核磁共振（NMR）等技術，研究者們進一步對PD-L1的跨膜結構域（PD-L1-TC）進行表征，描述其構象，并表明，當PD-L1與兩個膽固醇分子結合時可顯示出良好穩定性。

具體來看，PD-L1依賴于其跨膜結構域中的2個膽固醇結合基序——CRAC1和CRAC2基序，與膽固醇發生識別和互作。CRAC1 基序中的F257和F259結合位點通過疏水作用與膽固醇相互作用；CRAC2基序中的R260和R262結合位點通過氫鍵與膽固醇相互作用。在這種情況下，PD-L1被膽固醇包裹成“三明治結構”，從而增加其在細胞膜上的穩定性。

這倆基序長這個樣子

最后，研究者們驗證表明，PD-L1要是想“傍住”膽固醇來保全自己，依賴于CRAC1和CRAC2這兩個基序正常表達。

他們將這兩種基序上的膽固醇結合位點特異性敲除，分別生成表達PD-L1F257A、PD-L1F259A、PD-L1R260A和 PD-L1R262A突變體的RKO細胞。結果顯示，與表達野生型PD-L1的RKO細胞相比，這四種攜帶不同結合位點突變的RKO細胞內，PD-L1 mRNA水平相近，但PD-L1蛋白突變體的泛素化水平更高（下圖A）、降解速度更快（下圖C），且細胞膜表面PD-L1水平更低（下圖B）。

有了CRAC，膽固醇為PD-L1保駕護航，防止被泛素化降解

總的來說，PD-L1具有一種獨特的配置來保證其穩定性。依賴于兩個關鍵的CRAC膽固醇基序，PD-L1與膽固醇結合，防止自身被降解。當這兩個基序發生突變時，即會破壞PD-L1與膽固醇的結合作用，加劇PD-L1的降解。

來個簡單明了機制圖吧

另外，這項研究中再次證實，使用降低膽固醇的藥物進行治療，可以降低腫瘤細胞表面的PD-L1水平。但這與之前的研究結論還是有許多不同之處。

既往研究表明，他汀類藥物可通過抑制蛋白激酶B（AKT）和β-連環蛋白介導的信號通路，來降低腫瘤細胞中PD-L1的表達[3]。另外，辛伐他汀可通過抑制長鏈非編碼RNA（SNHG29） 的表達來抑制 PD-L1表達[4]。很明顯，兩項研究都顯示了他汀類藥物的間接作用，即調控PD-L1相關因子的活性，進而下調PD-L1水平。

而在這項研究中，歐陽波、王樹清、溫茂榮等人則是揭示了膽固醇對PD-L1的直接影響，為癌癥治療提供新策略——通過減少或去除膽固醇來降低腫瘤細胞表面的PD-L1水平，以此為原理或可開發用于癌癥治療的小分子抑制劑。

參考文獻：

[1]https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ade5927

[2]https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abq4722

[3]W. J. Lim, et al, Statins decrease programmed death-ligand 1 (PD-L1) by inhibiting AKT and beta-catenin signaling. Cells10, 2488 (2021).

[4]W. Ni, et al, Targeting cholesterol biosynthesis promotes anti-tumor immunity by inhibiting long noncoding RNA SNHG29-mediated YAP activation. Mol. Ther. 29, 2995–3010 (2021).