一些分子生物學實驗小技術2

5．有關融合蛋白表達載體的克隆
在構建融含蛋白表達載體時除了要注意插入片段的方向、讀碼框架與載體保持一致外，注意以下問題可能會減少一些不必要的麻煩，當外源片的插入載體起始密碼的后面，另一個基因的前面時，注意檢查插入后基因的兩端是否引入了新的終止密碼，特別是用到Klenow mung bean 核酸酶，T4 Polymerase 補齊，去粘末端等技術調整讀碼框時或不同酶切位點粘端連接時要注意。如XbaI識別序列隱含終止密碼，調整碼框時就要注意，又如BamH I酶切粘端為GATCC ＿補平后如果接到T 后面就有可能形成TGATCC這種隱含終止密碼的情況。（還有外源基因本身不可帶終止密碼）另外要注意啟動子后面避免出現幾個靠近的不同框架的ATG ，以減少對表達的影響。如果插入片段插到載體終止密碼前和另一個基因后面，則只用注意插入片段前方是否有終止密碼即可。
6．關于酶切
A．找不到適合的酶切位點。由于各廠家不定期的推出新的限制性內切酶品種，這些酶切識別序列可能尚未在有關Catalog 上出現，用現有的軟件也查不到這些酶切點，如New England Biola 公司前一段時間剛推出了20多種新的內切酶。請隨時向各廠家或供應商查詢，并記得將新的品種加入到您的記錄中以便查閱，這些新的內切酶有可能正是您要找的呢。

B．在文獻上找到的內切酶在廠家目錄上找不到。由于來源不同，許多識別序列，酶切點完全本同的酶會有不同的名字，各供應商目錄往往會有相應的附錄以供用戶查詢，比如在New England Biola 的Catalog 后面20項或基因有限公司2000Catalag前面都附有相當完整的內切酶列表（含1999年以前絕大部分商品化的酶），從左邊一欄尋找你已知的酶的名字，找到后可以查出相應的識別序列，各種同功酶的名稱，

酶在NEB 廠家所用的名稱和目錄號等。另外也可以通過已知酶的識別序列在相應的表中找到相應的酶名稱。當然這些表可能不含最新發現的酶。
C．Dam Den 甲基化對酶切點的影響。有時用試劑盒純化的質粒用別的酶都切得動，用Bcl I ，等酶就是切不動。原因在于多數實驗室常用的Ecoli 菌株都有甲基化的功能，而BclI是一個甲基化敏感的酶。當其識別序列被甲基化后BclI就出現切不動的情況。而Bam HI則對甲基化不敏感，所以甲基化與否都照切不誤。當你要用BclI這類切點時，請選用甲基化缺陷的Ecoli 菌株如GM119 或其他菌種。有的內切酶對甲基化敏感與否取決于其識別序列兩端的堿基，詳細資料請參考廠家目錄的有關附錄，如NEB 目錄268 、269 頁。
D．同進進行雙酶切要注意：
①任何時候2 種酶的總量不能超過反應體系的0.1②雙酶切時如果兩種酶反應溫度一致而buffer不同時，可查閱內切酶供應商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表（NEB 目錄251 ）頁，如果有一種buffer能2 使種酶的活力都超過70% 的話，即可用這種buffer. 如果兩種酶廠家不同無法查時可比較其buffer成份，相似的話可各取一半中和。

③如果2 個酶buffer成份相差較大或2 個酶的反應溫度不同則必需分別做酶切。廠家目錄一般都會有相應的附錄以供查詢各種酶的反應溫度。

④第一個酶切后可以電泳確證酶切完全后從膠中回收DNA 再進行下次酶切也可以在第一個酶切后用PCR 產物回收試劑盒或Nucleotide Removal Kit純化酶切樣，保留少量做電泳分析之用后再進行下一次酶切。還有一種屯化管（eendorf 等廠家有售），將酶切樣加入后離心，鹽等成份被甩掉而核酸則被截留在柱子中間的膜上，加入ddH2O 離心洗滌后加幾微升在膜上，將柱子反轉插入新的eerdorf 管上離心即可將DNA 片段離下來，做下一次酶切。

⑤特別注意，雙酶切載體時如果2 個酶切位點靠得很近，必須注意酶切順序，因為不同的內切酶對其識別位點兩端堿基數目要求不同，有的酶要求識別序列兩端有多個堿基的必須先切，比如LITMUS29中先切BamHI 再切Hind 時就會出現切不動的情況。更詳細的數據可參考相應的附錄，如NEB 公司目錄的259 頁。
E．設計合成引物時加入酶切點往往為后繼的實驗帶來很多方便，比如PRC 產物經酶切后可以定向克隆到載體中，但在設計時需注意不同的限制性內切酶對其識別位點兩端的堿基數目要求不同。例如HindⅡCla Ⅰ，要求其識別序列5 端至少有多個堿基，這個酶才能切動，有的內切酶在兩端堿基不同時切割效率也不同，設計引物時要特別注意。有關數據可查詢各供應商附錄表，如NEB 公司第258-259 頁。
F．小量酶切時用較小的管化1.5 的管好，可以減少因為蒸發造成的體積減少，濃度改變。
7 、 有些酶切補齊后再連接會產生新的酶切位點

可以用來驗證是否補齊連接成功，例如Bam HI酶切補齊再連接后產生的序列可以被cla Ⅰ，ＤⅡ，Taq Ⅰ所切動。詳細資料可查詢供應商的附錄，如２６４－２６５8 、 有些酶的識別位點不同但產生的粘端是匹配的，可以直接連接Ⅱ，如Bcl I ，Bam HI和Ｂgl Ⅱ，酶切產生的粘端就是匹配的，可以直接連接。詳細資料可參考供應商的附錄如NEB 目錄的２６６－２６７9 、 各供應商送貨時往往會提供冰袋，在室溫下將化凍的大冰袋平整的一面整齊地插入1.5ml 或0.5ml 、0.2ml 的廢棄離心管；或將幾個小冰袋（化凍后）填料塞入一個小泡沫盒中壓實，再插入各種大小的廢管，放在-20 攝氏度凍24小時后了取出，拔出插入的廢管（可加點熱水以助拔管）即可做成一個科易冰盒，可在室溫下保持6-24小時的低溫呢（平時要在-20 攝氏度放置）在制冰機有問題或停電時就不用怕了。 10、用CLP 的10ml/200ml 兩用ti盒，這種盒的芯可調的，可以放10ml的小ti ，也可調整為放２００ml tip的盒，根據需要隨時轉換非常方便。
8．雙酶切小技巧
A．任何時候2 種酶的總量不能超過反應體系的1/10體積。

B．雙酶切時如果兩種酶反應溫度一致而buffer不同時，可查閱內切酶供應商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表（也可以向ebiotrade.com客戶服務部索取），如果有一種buffer能同時使2 種酶的活力都超過70% 的話，就可以用這種buffer作為反應buffer. 如果兩種酶廠家不同無法查時可比較其buffer成份，相似的話可以考慮各取一半中和。
C．如果2 種酶的buffer成份相差較大或2 種酶的反應溫度不同則必須分別做酶切。第1 種酶切后要考慮用酚抽、電泳或加熱等方法使酶失活后再進行下一次酶切反應。廠家目錄一般都會有相應的附錄以供查閱各種酶的反應溫度。有的酶可以用加熱使之失活，有的則不行，這些信息也可以在有關附錄中查詢，也可以向ebiotrade.com客戶服務部索取。

D． 第一次酶切后通過電泳確證酶切完全后可以從膠中回收DNA 片段再進行下次酶切，也可以在第一個酶切后直接用PCR 產物回收試劑盒或Nucleotide Removal Kit 純化酶切樣（只需5 分鐘），保留少量樣品做電泳分析之用，再進行下一次酶切。還可以用一種離心純化管或叫做離心濃縮管（Eendorf ，am 等廠家有售），將酶切樣加入后離心，鹽等成份被過濾掉而核酸則被截留在柱子中間的膜上，加入適量ddH2O ，離心以洗去膜上殘留的雜質，再加幾微升ddH2O 在膜上，將柱子反轉插入新的eendorf 管上，離心，即可將DNA 片段離下來，做下一次酶切。

E．特別注意：在雙酶切載體時如果2 個酶切位點靠得很近，必須注意酶切順序。因為有的限制性內切酶要求其識別序列的兩端至少保留有若干個堿基才能保證酶的有效切割。有的酶要求識別序列兩端有多個堿基的，則必須先切，否則就可能造成酶切失敗。比如質粒pLITMUS29 的多克隆位點中BamH I旁邊有HindIII 位點，如果先切BamH I再切HindIII 時就會出現HindIII 切不動的情況，但是反過來就沒問題。更詳細的數據可參考相應的附錄，也可以向ebiotrade.com 客戶服務部索取。
9． Dam Dcm 甲基化對酶切的影響。
有時質粒用別的酶都切得動，用Bcl I 、Cla I 等酶就是切不動。原因可能在于多數實驗室常用的E.coli菌株都有甲基化的功能，而BclI是一個對甲基化敏感的酶。當其識別序列被甲基化后BclI就出現切不動的情況。而BamH I則對甲基化不敏感，所以甲基化與否都照切不誤。當你要用BclI這類切點時，請選用甲基化缺陷的Ecoli 菌株如GM119 或其他菌種。有的內切酶對甲基化敏感與否取決于其識別序列兩端的堿基，例如Cla I ，3 ‘端相連的堿基為C 時就會對甲基化敏感。這樣的酶有好幾種，詳細資料請參考廠家目錄的有關附錄，或向ebiotrade.com 客戶服務部索取。
小玩意
1 、 各供應商送貨時往往會提供冰袋，在室溫下將化凍的大冰袋平整的一面整齊地插入1.5ml 或0.5ml 、0.2ml 的廢棄離心管；或將幾個化凍后的小冰袋填料塞入一個小泡沫盒中壓實，再插入各種大小的試管，放在-20 攝氏度下凍24小時后取出，拔出插入的廢管（可加點熱水以助拔管）即可做成一個簡易冰盒，可在室溫下保持6-24小時的低溫呢（不用時要放在-20 攝氏度下存放）。在制冰機有問題或臨時停電時就不用怕了。

2 、有一種10μl/200 μl 兩用ti盒，這種盒的芯可調的，可以放10μl 的小ti ，也可調整為放200 μl 的ti，根據需要隨時轉換，非常方便。