一文讀懂蛋白質轉印原理大分子量蛋白轉印有哪些技巧

　　通過凝膠電泳分離蛋白后，蛋白質被轉移到固體膜載體上進行后續步驟。有效的轉印依賴于膜的選擇、所使用的轉印設備的類型以及轉印緩沖液的組成。

　　轉印條件

　　蛋白的有效轉印依賴于蛋白質從凝膠中遷移出來，也依賴于蛋白在膜上的滯留。像凝膠電泳一樣，轉印步驟將帶負電荷的蛋白轉印到帶正電荷的電極上。轉印效率受所用轉印設備的類型、蛋白類型、轉印緩沖液和轉印條件的影響。

　　濕轉和半干轉

　　Western blotting常用兩種傳輸設置：濕轉(圖1.3和表1.4)和半干轉(圖1.4和表1.5)。

　　濕轉-在濕轉裝置中，一個“三明治結構”被組裝起來，由凝膠和膜組成，膜的兩側放幾層濾紙。濾紙-凝膠-膜-濾紙夾芯的，每一面都有海綿狀的纖維墊，組裝完成后，將其放入充滿轉印緩沖液的轉印槽中，電流通過緩沖液將蛋白從凝膠轉印到凝膠中。

　　通過改變緩沖系統(見下一節)、轉印時間和轉印電壓，可以優化蛋白從凝膠到膜的轉印。

　　濕轉方法用于大多數印跡應用，并提供高度一致的結果。該方法特別適用于轉印分子量范圍廣的蛋白，由于其一致性，定量分析時推薦濕轉。

　　濕轉的缺點之一是每次轉印需要大量的緩沖液。另一個缺點是熱量的產生，特別是在較長的轉印過程中。過多的熱量會導致凝膠間不一致的轉移，蛋白變性，甚至凝膠的破壞。因此，強烈建議使用冰袋、冷卻循環器，保持轉印設備的冷卻。

　　半干法轉印-半干法轉印裝置使用與濕法轉印類似的堆疊，但是“三明治”結構放置在兩個電極板之間，而不是浸入充滿緩沖液的裝置中(圖1.4)。因此，該方法避免了濕轉系統所需的大量緩沖液(表1.5)。

　　半干式轉印裝置的最大優點是轉印速度快。由于電極之間的距離被減到最小，產生了一個強電場，從而可快速轉印。該方法的另一個優點是，凝膠兩邊使用不同的緩沖液——一邊促進蛋白從凝膠轉移到膜上，另一邊促進蛋白在膜上停留。

　　然而，強電場也是這種方法的一個缺點。低分子量的蛋白可能會轉過，此外較大分子量蛋白所需的轉印時間較長，但是緩沖液的量有限。

　　轉印緩沖液

　　轉印緩沖液含有多種促進蛋白轉印的成分(表1.6)。緩沖液的優化是基于所使用的轉印系統類型(濕轉或半干轉)、使用的凝膠類型、膜的選擇和感興趣的蛋白。

　　緩沖液特性——轉印緩沖液必須具有強大的緩沖能力，以在轉印過程中保持傳導率和pH值的穩定。緩沖液的pH值必須與相關蛋白的等電點(pI)不同，否則蛋白不會發生轉移。

　　最常見的緩沖液是pH值為8.1-8.5的Tris，高于大多數蛋白的pI。當轉印高分子量或堿性蛋白時，也可以使用較高的pH緩沖液，如CAPS或碳酸鹽。

　　電壓和時間

　　每次轉印應優化時間和電壓。雖然蛋白在高電壓下轉移更快，但轉移效率并不總是一致的。不足的電流或時間可能導致不完全轉印，而高電流或較長的轉移時間可能導致蛋白透過膜。轉移條件指南通常與轉移設備一起提供。然而，這些條件可以根據感興趣的蛋白進行調整。一般來說，較長的轉印時間和較低的電流，用于濕轉，而較短的轉印時間與高電流用于半干轉。

　　我們將給5點建議，幫助膠上大分子量蛋白的轉印。

　　01

　　犧牲膠的韌性來提高效率

　　低濃度的丙烯酰胺凝膠可能難以操作。一旦手指觸摸它就會撕裂？ 但是，與高濃度的凝膠相比，大蛋白將更有效地從較低濃度的凝膠中移出（分辨率更好）。因此，提高你的靈活性和耐心，嘗試6-7.5％的凝膠。 或者可以嘗試使用梯度凝膠，可以同時分辨小分子量和大分子量蛋白質。

　　02

　　去除去垢劑

　　較大的蛋白質可能在凝膠中沉淀，抑制轉印。 在SDS-PAGE期間添加的SDS通常會解決這個問題，但較大的蛋白質可能需要更多的SDS。 您可以在轉印緩沖液中添加最多0.1％的SDS以阻止沉淀的產生。因為SDS抑制蛋白質與膜的結合，因此請嘗試從低濃度的SDS開始（例如0.0375％），然后逐步提高。

　　如果確實在轉印緩沖液中添加了SDS，則需要重新優化其他轉印條件，如轉印時間和電流，以防止蛋白透過膜。

　　03

　　降低甲醇濃度

　　甲醇與SDS具有相反的作用。 雖然甲醇增加蛋白與膜的結合，但它從蛋白質中剝離SDS。 因此，降低轉印緩沖液中的甲醇濃度也有助于防止蛋白沉淀。 您可以將濃度降低到10％或更低。 如果您使用的是PVDF膜，則可以完全省去甲醇。 在使用之前，不要忘記用甲醇將膜激活！

　　甲醇也會導致凝膠收縮，所以如果減少甲醇，你的凝膠會膨脹得更多。 這也有助于轉移大分子量蛋白。 但您可能需要使用比正常情況稍大的濾紙和膜。

　　04

　　慢速轉印大分子量蛋白

　　大分子量蛋白想要獲得良好的轉移效率可能需要更多時間。 快速移動那些大分子可能很困難。 嘗試以較低的電壓過夜轉印。 只是不要忘記保持轉印要在低溫環境！

　　05

　　使用濕轉

　　雖然半干轉印可能更適合設置并且需要較少的緩沖液，但它確實有其缺點。 半干轉印通常比濕轉移效率低，并且不能增加轉印時間以適應更大的蛋白。 轉移大蛋白時最好堅持使用濕轉。