一種新的具有高檢測覆蓋面的靶向代謝組學方法

　　文章題目為SWATHtoMRM: Development of High-Coverage Targeted Metabolomics Method Using SWATH Technology for Biomarker Discovery，是由中科院生物與化學交叉研究中心的朱正江研究員課題組在2018年發表于Analytical Chemistry上的一篇文章。

　　代謝組學是一門全面研究生物體內代謝物的種類和濃度變化的一門學科。內源性代謝產物往往具有復雜的物理化學性質，以及較寬的濃度范圍（據文獻報道大約有可以跨越9個數量級）。這就使得代謝組學的研究需要依賴于強大的分析手段，使得整個研究可以覆蓋更多的代謝物，具有較高的靈敏度和選擇性以及較寬的動態范圍。目前液相色譜-質譜聯用技術是使用較為廣泛的一種分析技術。

　　非靶向代謝組學使用高分辨質譜，可以盡可能多的檢測到生物樣本中的代謝物，但是其缺點在于該方法的定量準確性較差。靶向代謝組學使用三重四極桿質譜，在多反應離子檢測模式（MRM）下進行操作，定量的準確性和動態線性范圍大大提高，但是有限的離子通道和有限的代謝物標準品又使得該方法在檢測的覆蓋面上遠不如非靶向代謝組學。因此作者在此就想建立一種方法，用靶向代謝組學的方法同時對已知樣本和未知樣本同時進行定量分析。

　　作者使用SWATH-MS方法（數據非依賴型掃描，DIA的一種）對樣本進行數據采集，得到的原始數據經過軟件的處理建立MRM的離子通道。

　　其實類似的方法近期已有報道，而本文的創新在于MRM離子通道的選擇，傳統的方法中多數是使用數據依賴型掃描（DDA）的方式來獲取 母離子→子離子 通道，原因可能是該方法可以告訴我們某一碎片來自具體的某一個母離子。

　　而DIA的方法會對同一時間流出色譜柱的離子同時加能量進行碎裂，所得到的碎片離子其實是幾個甚至幾十個母離子的碎片的混合圖譜，如不借助專業軟件，將增加研究者篩選的難度。

　　而本文使用SWATH-MS方法，將質量窗口縮小值25Da，通過降低共流出離子的數量提高質譜峰的潔凈程度（當然還是會有共流出的產生），作者也設計了一個程序幫助研究者從相對較少的共流出離子的混合碎片中提取 母離子→子離 子離子對。另外，相比于DDA分析，DIA分析可以得到更多母離子的子離子。（關于掃描模式的內容，可以參看公眾號之前推送）

　　那接下來就看一下文章的核心部分：

　　1. SWATH-MS數據采集及數據分析

　　作者將所建立的方法稱之為SWATHtoMRM，通俗來講就是SWATH（獲取原始數據，提取整合原始數據，獲得 母離子→子離子 列表）to MRM（離子通道進行定量分析）。

　　SWATHtoMRM的具體流程，主要包括兩個部分，非靶向的SWATH-MS分析和生成MRM離子通道即 母離子→子離子 列表。

　　SWATH-MS原始數據的分析主要包括：1.對母離子色譜峰進行提取和排列；2. 提取子離子信息； 3. 將母離子和子離子信息進行匹配； 4. 生成共有子離子譜圖（來自同一母離子的碎片中，在超過50%以上的樣本中出現的子離子）。每一步作者都是用了不同的軟件，有網絡開放獲取的軟件，也有作者研究團隊自己開發的程序。

　　2. 生成MRM離子通道（母離子→子離子 列表）

　　在對SWATH-MS數據進行分析之后，會得到目標離子對應的子離子，但是在進行MRM分析時需要對其中的某一個或者某幾個子離子進行監測，所以這個時候就需要選擇合適的子離子碎片，來生成 母離子→子離子 列表。

　　為了選擇合理的離子通道，作者制訂了以下三個篩選的條件：1. 子離子質荷比＜母離子質荷比-14.0126，也就是說篩選的子離子至少從母離子上丟失一個“CH2”基團；2. 去除由于中性丟失產生的碎片，如丟失H2O，NH3或者CO2，用戶還可以設置更多的中性丟失；3. 在剩下的碎片離子中，選擇強度最高的碎片離子作為檢測對象。最后，作者為每一個母離子選擇了一個子離子，之后生成.csv文件用于MRM分析。

　　作者將此方法與傳統的DDA進行對比，結果顯示新建立的方法具有更高的檢測覆蓋面。

　　此外，作者還對其定量的能力做了考察，相比于SWATH-MS1和SWATH-MS2，新建立的方法具有較高的檢測靈敏度，較寬的動態范圍以及較好的定量重現性。

　　最后，作者將此方法應用于結直腸癌診斷的生物標記物的發現，以證明方法的適用性。