不同標記與非標記蛋白質組學定量準確性分析研究

　　通過質譜法進行定量蛋白質組分析為生物醫學探索研究提供非常重要的途徑。 然而，了解生物樣品中的定量限制對于準確判斷結果非常重要。通過使用加入已知濃度的蛋白質標準品的復雜樣本，科學家們研究了無標記（label free）和基于標記（TMT和iTRAQ）的肽定量的定量限制，包括前體混合的評估及其對同重元素標記的定量準確性的影響。

　　使用哺乳動物細胞系作為背景制備樣品，其中分別加入不同的蛋白質標準品（共57種）。蛋白質標準品含有48種人蛋白質，每6種蛋白質混合加入一組樣本，標準品蛋白的量覆蓋5個數量級范圍（從50pmol至500amol）。混合物以8個線性梯度稀釋，得到0-25000fmol的蛋白質量。 另外9種蛋白質，其中3種非哺乳動物：P14R（合成的），TPI和MBP B-Gal（大腸桿菌）以等摩爾濃度混合，并以8個Log4濃度覆蓋0-15000fmol。image004.jpg相同樣本通過label free方法鑒定了3386種蛋白質，使用iTRAQ標記鑒定了4466種蛋白質，使用TMT標記鑒定了5961種蛋白質。TMT定量鑒定獲得最多的蛋白數量。

　　同時標記和非標記的方法都能在低至1 fmol的線性范圍內定量。實驗結果表明， TMT標記較 iTRAQ標記更敏感，噪音信號水平更低。

　　假設平均蛋白質大小為50kDa， 1fmol的較低檢測極限對應于約0.05ng /μL（50μg/ mL）。假設樣品制備中蛋白質損失為零，則檢測下限將是原始樣品溶液中蛋白質濃度> 50 ng / mL。為了獲得細胞蛋白質拷貝數1fmol將對應于；通過乘以阿伏加德羅常數來計算1 fmol的蛋白質數量。為了獲得每個細胞的蛋白質數量，我們將其與產生20μg的細胞數量分開，這是每個通道標記的蛋白質量。假定mcf-7細胞系的蛋白質產量為400μg/百萬細胞。根據估計，1 fmol對應于每個細胞大約12000個拷貝的蛋白數量，具有該范圍內的細胞拷貝數的蛋白質屬于中低豐度。

　　參考文獻

　　Quantitative accuracy in mass spectrometry based proteomics of complex samples: the impact of labeling and precursor interference. J Proteomics. 2014 Jan 16；96:133-44