串色問題

當多標樣品用兩種以上的激光掃描時，串色問題在好幾個通道都會觀察到，圖 5（ c）和圖 5(f)顯示了鼠腦的一個厚切片，用 Alexa Fluor488 標記神經絲、用 Alexa Fluor 568 標記神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)，用 DRAQ5 染核。當樣品同時用 3 個激光掃描時（圖 5c），串色會在第二和第三個通道發生，在樣品的中間絲里就意味著有可能的共定位。然而，若開始用序列掃描并收集數據時，神經絲只出現在它們各自的通道里（圖 5f），消除了這些結構中熒光團共定位的可能。熒光共振能量轉移(FRET)，理論上可以測量位置離得很近的兩個熒光團的距離，也是監測共定位的一個潛在有用的工具。然而，在共定位分析中這個現象經常會導致一些假象，除非在實驗的設計過程中，對 FRET 的一些參數做了很好地理解并認真進行了考慮。尤其是在第一個熒光團的發射光譜和第二個熒光團的激發光譜重疊的地方，研究者應該特別關注。這些樣品中的能量轉移表現為：第一個熒光團的熒光發射意外地降低同時伴隨著第二個熒光團的熒光發射意外地增加。緊密相關的熒光團之間的相互作用可導致發射熒光信號的淬滅，這與環境條件有關。

共定位分析中許多潛在的問題都可通過仔細關注樣品制備技術來規避。正如上面討論的，熒光探針應該選擇發射光譜分離比較大的且具有最小疊加的組合。如果可能的話，選擇綠顏色的具有窄發射的熒光團（比如 Alexa Fluor 系列或量子點）及紅顏色的在深紅區或近紅外區有發射的熒光團。原發性和繼發性抗體必須檢測交叉活性及非特異性背景染色。合成熒光團及標記的繼發性抗體的濃度應該優化以確保相似的亮度，尤其是當對象豐度根本不同時。影響熒光團亮度的因素包括激發效率、量子產率、消光系數、濃度及環境因素，如 pH值、離子濃度、疏水性及粘性。對每一個熒光團都應單獨制備 control 樣品，在不染色的情況下，分別分析串色和自熒光。仔細注意著色過程中的微小細節，就會降低使用圖像處理軟件恢復數字圖像的必要性。